李 娟,李从荣,李 艳,顾 剑

(武汉大学人民医院检验科,湖北武汉430060)

深部真菌感染往往继发于其他系统性疾病,临床表现不典型,容易与原发病相混淆,诊断比较困难,而治疗时机的延误往往导致高感染率和高死亡率。来自美国休斯顿的一项研究表明,早期抗真菌治疗可极大改善病人预后[1]。

念珠菌属是深部真菌感染中最常见的病原菌,且存在天然耐药现象。本研究以18S rDNA基因和5.8S rDNA基因的保守序列设计真菌通用引物,以内转录间隔区ITS1段设计种特异性探针,利用PCR结合反向膜杂交技术,达到快速检测临床常见致病念珠菌的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及生物学试剂 白色念珠菌,热带念珠菌,近平滑念珠菌,都柏林念珠菌,光滑念珠菌,克柔念珠菌,均是来源于卫生部临检中心质控菌株;季也蒙念珠菌;葡萄牙念珠菌;毛霉菌;清酒酵母;新生隐球菌;曲霉菌均由本院微生物室从临床标本中分离。Taq DNA聚合酶,10×PCR buffer,MgCl2,dNTPs;DNA marker,TE缓冲液(pH 8.0);TdT末端脱氧核苷转移酶;尼龙杂交膜;dTTP均由日本TaKaRa公司公司提供。凯普杂交配套试剂:由凯普科技生物公司提供。

1.1.2 引物及探针的设计

①参考Catriona Halliday[2]等人设计的通用引物扩增真菌转录间隔区ITS1。Its1F:19TCCGTAGGGAA CCTGCGG37;its1R:237CGCTGCGYTCTTCATCGATG208。3'端均采用生物素标记。

②根据ITS1基因序列多态性设计探针[3]

探针序列(5'→3') Tm(℃)C.albicans TTTATCAACTTGTCACACCAGA 68.4 C.tropicalis CTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACC 64.5 C.krusei TGTGGAATATAGCATATAGTCGACAAGAG 64.8 C.glabrata TGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATC 68.2 C.dubliniensis ACATGTGTTTTGTTYTGGACAAACTTG 67.3 C.parapsilosis CTGCCAGAGATTAAACTCAACCAA 65.1

阳性对照探针:TCCGTAGGGAACCTGCGG

1.2 方法

1.2.1 采用蛋白酶K-SDS法提DNA[4],置于4℃备用。

1.2.2 PCR 反应 10×PCR Buffer 2.5 μ l,2.0 mmol/L dNTP 2.5 μ l,1.5 mmol/L MgCl21.5 μ l,10 pmol/L生物素标记的上、下游通用引物各1 μ l,0.5 U Taq DNA 聚合酶 1.0 μ l,DNA 模板 5 μ l,双蒸水补足至25 μ l。97℃预变性10 min后,进入循环。95℃变性3 min,53℃退火30 s,72℃延伸60 s,35个循环后,72℃延伸7 min。

1.2.3 反向膜杂交 杂交膜的制备:5×dTTP buffer 4 μ l,TdT 4 μ l,dTTP 5 μ l,10 pmol oligo 1 μ l,双蒸水补足至 20 μ l体积,于 37 ℃水浴60 min,后加入 2 μ l 0.5 mmol/L EDTA,70℃s水浴10 min行终止反应。……