兰 晶

(安阳市人民医院妇产科,河南安阳455000)

本文通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(FQRT-PCR),检测β-hCG-mRNA,建立在外周血中检出滋养细胞方法,推测妊娠肿瘤患者外周血中滋养细胞的含量,为肿瘤的发展转移做预防。

1 资料和方法

1.1 临床资料

11例患者中,绒毛膜癌6例,临床分期:Ⅰ期2例,Ⅱ期3例,Ⅲ期 1例;葡萄胎5例,临床分期:Ⅰ期1例,Ⅱ a期2例,Ⅲb期1例;Ⅳ期1例,各例均于治疗前采集外周血10 ml。非妊娠期妇女血液来自辽宁省血液中心。均为健康新鲜血液。

1.2 试剂与仪器

JAR细胞株购自中科院上海细胞库;新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);IV胶原酶(美国Sigma公司);TRIZOL RNA提取液(美国Gibeo BRL公司);琼脂糖(美国Promega公司);RPNI 1640培养液(北京万域美澜科技);电泳仪及电泳槽(美国Bio伯乐公司);CO2培养箱(美国Forma公司);紫外分光光度仪(北京凯慕公司);2720 FQ-PCR仪(美国ABI公司);低温高速离心机(德国Eppendorf公司);Ficoll(上海试剂二厂);焦碳酸二乙酯;(美国BIO伯乐公司);DNase I(上海浩然生物技术公司);M-MLV逆转录系统(美国1NB公司);PCR反应体系(上海生物工程有限公司);100 bp PCR 1VIarker(英国INB公司);荧光探针由美国PE公司合成;引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 JAR细胞加入外周血中实验模型的建立JAR细胞接种于培养瓶中,24 h后取上清液,用PBS洗后用胶原酶消化2-3 min,加10%FCS吹打成细胞悬液,对细胞进行染色调整细胞浓度至1×10/ml,至1×107/ml。取非妊娠期妇女外周血与JAR细胞混合,每管10 ml。台盼蓝染色。

1.3.2 总RNA提取 TRIZOL试剂盒提取RNA,提取的经DNaseI处理以去除总RNA基因组DNA。紫外分光光度仪测定其量及纯度。

1.3.3 引物与探针 上游引物:5-TGC CAC CCT GGC TGT GGA-3;下游引物 :5-GCG GTA GTI”GCA CAC CAC CTG-3。荧光探针序列:5-TCA CCG TCA ACA CCA CCA TCT GTG C-3。

1.3.4 荧光定量逆转录-聚合酶(FQ-RT-PCR) 逆转录合成CDNA第一链,总反应体系补充无RNase水至20 ml。……