张 丹,李希宁,孙 波

(1.长春市中心医院心内科,吉林 长春130051;2.吉林大学药学院)

尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)是一种进化上高度保守的生长抑素样环肽,最早从硬骨鱼脊髓尾部下垂体中分离而来,其分布具有种属普遍性。Matsushita等[1]研究发现肾脏富含UⅡmRNA,现已证明,UⅡ对肾脏来说是一个自分泌或旁分泌的生长因子[2],可能与人类肾脏系统及其疾病的病理生理学有关。本研究通过体外培养大鼠肾脏成纤维细胞株NRK-49F,观察不同浓度UⅡ对大鼠肾成纤维细胞增殖及细胞外基质的影响,并且通过预先加入UⅡ抗体、尼莫地平和EDTA,观察其对UⅡ诱导NRK-49F细胞Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响,旨在探讨UⅡ在肾间质纤维化中可能发生的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞来源 大鼠肾脏成纤维细胞株NRK-49F细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心,以含10%小牛血清的DMEM培养基为基础培养基。

1.2 主要试剂 UⅡ(Sigma),逆转录酶SuperScriptⅡ(Invitrogen),TaqDNA聚合酶(北京天根生物技术公司),山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗体、兔抗大鼠Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,colⅠ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,colⅢ)及纤连蛋白(fibronectin,FN)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 MTT法检测不同浓度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol◦L-1)对NRK-49F 细胞增殖的影响。

1.4 ELISA法检测不同浓度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol◦L-1)对NRK-49F 各组培养上清colⅠ、colⅢ及FN含量的影响。

1.5 RT-PCR法检测各组培养细胞colⅠ、colⅢ及FN mRNA表达 根据加入条件培养基不同将细胞分为5组,对照组(常规培养)、UⅡ组(用含10-8UⅡmol◦L-1培养液培养);U Ⅱ抗体组(用 10-5mol◦L-1UⅡ抗体培养液预处理60 min后,换含UⅡ10-8mol◦L-1培养液继续培养)、尼莫地平组(以10-5mol◦L-1尼莫地平预处理5 min后,换含UⅡ10-8mol◦L-1培养液继续培养);EDTA 组(用2×10-3mol◦L-1EDTA预处理30 min后,换含UⅡ10-8mol◦L-1培养液继续培养)。引 物序 列 如下……