张俊仙 吴雪琼 阳幼荣 梁艳

众所周知,耐多药结核病已经严重影响了全球结核病的控制和治疗。耐多药结核病是指结核患者至少对利福平和异烟肼2种最主要的一线抗结核药物耐受。然而,由于结核分枝杆菌(Mycobacteriu m tuberculosis,Mtb)是慢生长分枝杆菌,常规的药敏试验需4～8周的时间,因此结核患者通常不能得到及时、有效的治疗,导致耐多药结核患者结核菌的增殖和传播。因此,需要建立一种操作简便、快速的药物敏感性试验方法,这对于控制耐多药结核病的传播具有重要的意义。

近年来出现很多耐药性检测的新方法,如PCR-单链构象多态性(PCR-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restrition fragment length polymophism,PCR-RFLP)、DNA 测序法、分子灯塔法、噬菌体生物扩增法等,都因为各种各样的问题难以在临床上广泛推广。笔者应用PCR-基因芯片和基因测序方法对30株利福平和异烟肼敏感株和50株利福平和异烟肼耐药株进行检测,以期为耐多药结核病的检测提供简单、快速、有效的方法。

材料与方法

一、菌株来源

80株Mtb临床分离株由本室保存,已按全国结核病细菌学检验标准化规程进行菌种鉴定证实为Mtb,并根据传统药敏试验结果选择30株利福平和异烟肼敏感株、50株耐利福平和异烟肼分离株。Mtb标准株H37Rv来自中国药品生物制品检定所。

二、试剂和仪器

Mtb耐药检测试剂盒(芯片法)购自北京百奥瑞生物技术有限公司。PCR扩增仪和 LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪等均为博奥生物有限公司提供。

三、细菌DNA的制备

采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,置-20℃保存备用[1]。

四、PCR扩增

按试剂盒说明书进行。每管PCR反应体系总体积为20 μ l,其中 Mtb分离株 DNA 模板为2 μ l,PCR扩增试剂1、PCR扩增试剂2和PCR扩增试剂3各 18 μ l。PCR产物1为对照产物,与两种微阵列都进行杂交。PCR产物2为rpoB基因的扩增产物,与利福平微阵列相对应;PCR产物3为katG基因及inhA基因启动子的扩增产物,与异烟肼微阵列相对应。PCR扩增程序为：37℃600 s,94℃600 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃40 s,35个循环;然后94℃30 s,72℃60 s,10个循环;最后置 72℃420 s。

五、基因芯片

检测探针和对照探针各重复5个点,每行1～5和6～10分别为同一个探针,利福平相关rpoB基因的探针排布示意见表1。异烟肼相关katG基因和inhA基因启动子的探针排布示意见表2。

六、芯片杂交和结果判读

根据试剂盒说明书进行操作。简而言之,每管含杂交缓冲液9 μ l,分别加入同一样品的PCR产物1和 PCR产物2各 3 μ l,或者加入 PCR产物 1和PCR产物3各3 μ l。置于PCR扩增仪中于95℃变性5 min,然后冰浴 3 min;将13.5μ l杂交反应混合物经盖片的加样孔加入,迅速盖上杂交盒并密封;放入50℃预热的恒温水浴锅中120 min;水平取出杂交盒,拆开取出芯片,洗涤后离心甩干。置LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪中读取信号、判读结果。

表1 利福平相关rpoB基因的探针排布

表2 异烟肼相关katG基因和inhA基因启动子的探针排布

七、PCR-直接测序法

根据Mtb序列,用软件Oligo 6.0设计利福平上下游测序引物rpoB3、rpoB4,可扩增rpoB基因产生240 bp片段,其中包括507～533位密码子之间81 bp热点区间的序列。设计异烟肼上下游测序引物 katG 1、katG2和 inhA1、inhA2,可分别扩增katG基因和inhA基因产生273 bp和255 bp片段,分别包括常见的katG基因315位密码子和inhA基因启动子-15位突变。扩增产物经2%琼脂糖电泳,均为阳性,说明没有基因缺失。扩增产物送上海生工生物工程公司进行基因测序。

结 果

一、芯片杂交结果

PCR-芯片杂交结果见表3。30株Mtb利福平敏感株rpoB基因、异烟肼敏感株katG基因和inhA基因芯片杂交结果与Mtb标准株结果一致,均为Mtb野生型。

50株Mtb耐利福平分离株中,7株芯片杂交为野生型;42株有单位点突变,1株有双位点突变。以80株Mtb临床分离株药敏检测结果为判断标准,芯片检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别是 86.00%(43/50)、100.00%(30/30)、100.00%(43/43)、81.08%(30/37)、91.25%(73/80)。43株耐药突变株中,28株(65.12%)为 rpoB基因 531位突变,其中 26株TCG→T TG突变,2株 TCG→TGG突变;6株(13.95%)为526位突变,其中4株CAC→TAC突变,1株CAC→CGC突变,1株CAC→GAC突变;4株(9.30%)516位突变,2株GAC→GTC突变,2株GAC→TAC突变;3株(6.97%)511位突变,均为CTG→CCG突变;1株(2.33%)513位CAA→AAA突变;1株(2.33%)双位点突变为 511位CTG→CCG和516位GAC→GGC突变。部分芯片杂交结果见图1。

表3 50株利福平和异烟肼耐药株PCR-基因芯片检测与基因测序结果

图1 Mtb利福平rpoB基因部分芯片杂交图

50株Mtb异烟肼耐药株中,14株芯片杂交均为野生型,36株有katG和/或inhA突变,芯片检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率分别.72.00%(36/50)、100.00%(30/30)、100.00%(36/36)、68.18%(30/44)、82.50%(66/80)。31株芯片检测有katG突变的分离株中,30株315位AGC→ACC突变和1株315位AGC→AAC突变;7株芯片检测有inhA突变的分离株均为-15位C→T突变;其中2株既有katG突变又有inhA突变。部分芯片杂交结果见图2。

二、PCR-直接测序结果

结果见表3。30株Mtb利福平和异烟肼敏感株DNA测序结果与基因芯片检测结果一致,均为Mtb野生型。

图2.tb异烟肼katG基因和inhA启动子芯片杂交图

50株Mtb耐利福平分离株中,44株基因测序结果与PCR-基因芯片检测结果一致,其中3株均为rpoB野生型,41株均为突变型。6株基因测序结果与PCR-基因芯片检测结果不一致,其中4株为单位点突变,芯片上无相应的探针(分别是531位TCG→TAG、515位 ATG→ATA、513位 CAA→CAT和522位TCG→CAG);2株测序结果为双位点突变,其中各有1个突变位点芯片上无相应的探针,分别是516位GAC→AAC、526位CAC→CAG 突变。

50株Mtb耐异烟肼分离株中,47株katG基因测序结果与 PCR-基因芯片检测结果一致,其中16株均为野生型,31株均为315位密码子突变;3株katG基因测序结果与 PCR-基因芯片不一致,芯片上无相应的探针,分别为299位GGC→GTC突变、322位ACG→GCG突变和 291位 GCT→GAT突变。37株inhA基因测序结果与PCR-基因芯片检测结果一致,其中30株均为野生型,7株均为-15位突变型;13株inhA基因测序结果与PCR-基因芯片检测结果不一致,芯片上无相应的探针,其中10株为68位G→A突变,3株分别为-8位T→C、-21位G→C和-17位G→T突变。

讨 论

目前的研究表明,大约95%以上的Mtb耐利福平分离株在RNA聚合酶β亚单位编码基因rpoB的507-533位密码子的81bp热点区域有突变[2],90%的点突变发生在该区域11个氨基酸密码子之一的部位,其中最常见的突变位点是531位、526位和516位,并且531＞526＞516[3-5]。而Mtb耐异烟肼主要与katG基因和inhA启动子突变有关,katG基因最常见的突变是315位密码子AGC→ACC的突变,该突变引起过氧化氢酶活性降低,导致异烟肼耐药[6]。InhA基因编码脂肪酸转运蛋白(NADH依赖的enoyl-ACP还原酶),是分枝菌酸细胞壁合成的必需成分,活化的异烟肼结合到NADH上抑制了依赖NADH酶的活性,抑制了分枝菌酸的合成而导致了细胞的死亡。inhA基因的突变修改了该酶,使它失去了和NADH的亲和力,导致异烟肼耐药[7-8]。因此,这些区域是利福平和异烟肼耐药株分子检测的主要靶位[9-11]。

基因芯片技术是目前分子诊断的先进方法。国内外很多专家分别报道用基因芯片检测耐利福平Mtb标本,其检测结果与测序结果大多数相符[12-13]。因此,应用基因芯片快速检出rpoB基因、katG基因和inhA基因突变可以作为耐多药结核病的诊断指标。

本研究应用已商品化的基因芯片分析Mtb rpoB基因的6个野生型和13个突变型位点,分析katG基因315位密码子的1个野生型和2个突变型及inhA基因启动子区-15位的野生型和突变型,因此,可检出耐多药结核病常见的基因突变位点。

本实验中30株Mtb利福平和异烟肼敏感株中,DNA芯片杂交结果也均为野生型,特异度为100.00%。50株耐利福平临床分离株中43株可检测到rpoB基因突变,灵敏度为86.00%,与郭乃洲等[14]报道的一致。这是因为该基因阵列探针只包括最常见的13种突变,基因测序结果证明4株突变株芯片上无相应的突变探针,因此,基因芯片检测的灵敏度低于基因测序。此外,3株在分析的部位未发现基因突变,有可能在本检测范围外的其他位点存在突变,或者是存在其他耐药机制,或者传统药敏实验误差所致。本试验中,检测到的最常见的突变位点也是531位、526位和516位密码子,与报道一致。

50株Mtb耐异烟肼分离株中,36株有katG和(或)inhA突变,灵敏度为 72.00%,其中katG 基因突变率为62%,与袁瑛等[15]、菅记涌等[16]报道的一致;inhA-15位基因突变率仅为 14%,与Morris等[17]报道的一致。由于芯片只能检测到常见的野生型和突变型,因此,katG基因测序显示的3株少见的突变基因型芯片未能检出。此外,16株在分析的部位未发现基因突变,笔者将进一步分析,查找原因。

在耐异烟肼分离株中,通过PCR-基因芯片只检出7株inhA-15位C→T突变,但基因测序发现10株芯片检测敏感的菌株存在inhA 68位G→A突变,该突变为首次报道,它在异烟肼敏感菌株中不存在,但在测序证实的20株inhA基因突变株中,该突变基因型占了50%,高于inhA-15位突变,该突变是否与异烟肼耐受相关尚需进一步研究证实。

总之,用PCR-基因芯片可快速、特异地检测出大多数Mtb耐多药分离株,用于临床耐药性检测,可指导临床治疗。

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