李艳花

（山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009）

拟南芥Formin家族蛋白AFH14基因的克隆及功能结构域分析

李艳花

（山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009）

应用RT-PCR的方法从拟南芥cDNA中克隆了AFH14的全序列，并对其功能结构域进行分析。发现所克隆的目的基因编码区全长3 102bp，与基因组序列比对发现该基因包含18个内含子和18个外显子，编码1 033个氨基酸残基。通过与其它formin成员的序列比对分析，发现AFH14是一个典型的拟南芥II型formin，包括PTEN结构域。

AFH14；Formin；PTEN；FH1；FH2

Formin蛋白是一类高度保守的多结构域蛋白，在多个物种中都有较多的发现。而且，除了植物，几乎现有的常用于细胞生物学研究的物种都有发现。formin是既和微丝互作也和微管互作［1-2］。植物formin根据结构域组成上的不同分为I型和II型两大类，目前关于植物formin的研究大都集中在I型formin上［3］，尚没有关于高等植物II型formin的研究报道。AFH14属于一个典型的II型formin，该基因的研究将拓展我们对植物formin蛋白家族成员的认识，有助于揭示它对微管微丝动态过程的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

供试材料为任海云实验室保存的哥伦比亚0型野生拟南芥。种植条件：拟南芥种子在4℃冰箱中，冷处理3d，然后种植在Hoagland拟南芥培养基（含1.2％琼脂，3％的蔗糖）上，光周期为光照16h，黑暗8h，温度为22～24℃，生长至7d的小苗用来提取RNA。

1.1.2 试剂

RNA提取试剂盒购自奥莱博生物科技有限公司，DEPC水购自Sigma公司。反转录试剂盒：采用invitrogen的Superscript III，pfu DNA聚合酶，dNTP，DNA连接酶以及限制性内切酶均购自Takara公司，DL2000plus Marker来自全式金。引物合成和测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥小苗RNA的提取和cDNA的获得

1）拟南芥小苗总RNA的提取按照RNA提取说明书（AutoLab生物技术）说明书完成，并使用核酸蛋白测定仪检测RNA均一性。

2）反转录cDNA获得

体系中包括5 μg RNA，0.5 μg Oligod T，补DEPC-ddH2O至13.3μL。之后70℃，5min，冰浴至少2min。在上述体系中加入以下物质：5 μL 5×M-MLV reaction buffer，5μL dNTP，0.7μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV，补DEPC-ddH2O至25μL。42℃，60min温育。

1.2.2 PCR扩增

应用Primer Premier 5软件，根据已登录TAIR数据库中预测的AFH14的cDNA的序列和unigene中公布的EST序列设计引物：AFH14f：5＇ATGTCTTTGTTAAGTAGATTCTTTTACA3′，AFH14r：5＇TGTTCTATGTCTATGGATCTGCTG3′；使用TaKaRa的pfu系统，退火温度为53℃，延伸3min，经过35轮退火延伸。

1.2.3 基因克隆与序列分析

扩增产生核酸产物经电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收产物与线性克隆载体pGEMT-5Z进行平端化连接，转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑取白色单克隆细胞进行扩大培养。选取经琼脂糖电泳、PCR、酶切检测阳性的质粒送英潍捷基公司测序，测序结果通过DNAman、Clustal W软件进行序列拼接和比对分析。

2 结果

2.1 AFH14cDNA的克隆、鉴定及生物信息学分析

AFH14是一个典型的II型formin，NCBI上搜索，发现Genebank中含有AFH14的cDNA序列预测，而且基因组注释中存在大量的关于该基因在植株中表达的microarray数据。因此本研究以AFH14为研究对象，拟采用RT-PCR方法扩增出该基因的CDS，从而为进一步研究该基因功能奠定基础。

2.2 拟南芥AFH14cDNA的克隆、鉴定

2.2.1 总RNA及其质量鉴定

总RNA的质量好坏是反转录cDNA成败的关键。本工作利用固体培养基培养7d的拟南芥幼苗为材料，提取总RNA。取5μL拟南芥总RNA，加入1μL的6×Loading buffer，经200V，5min琼脂糖电泳，发现28S和18S条带清晰，亮度比例大约2∶1，表明提取RNA质量较好，见图1。另外，取1μLRNA和99μL DEPC处理水，用核酸蛋白测定仪测定OD260和0D280的值，多次测定取平均值。计算OD260/0D280=2.0，表示所提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组污染。

图1 拟南芥总RNA琼脂糖凝胶电泳

2.2.2 AFH14 CDS的扩增与鉴定

利用上述RNA为模板，经Superscript III逆转录酶产生cDNA，并以该cDNA为模板，以AFH14f和AFH14r为引物，按材料与方法中所述条件进行PCR。经1.0％琼脂糖电泳检测，在3 000bp左右有明显条带，见图2（箭头所示），胶回收后并连接至pGEM-5Z Vector中得到质粒pGEM-AFH14，克隆载体pGEM-AFH14经PCR、酶切鉴定正确后，进行测序分析。测序分析表明所克隆到的序列长3 102bp，与TAIR上所预测的序列不完全一致，克隆片段缺少预测片段中从1 510～2 101的序列。进一步重复实验证明，该基因的CDS中确实是没有这一片段。通过与基因组序列比对分析发现AFH14基因包括18个外显子，18个内含子。

图2 RT-PCR产物的电泳结果

2.3 AFH14全长蛋白结构域及同源性分析

使用DNAMAN软件分析显示，扩增得到的AFH14核苷酸序列编码的蛋白全长1 033aa，预测该蛋白的等电点为6.34，分子量为116.3kDa。像formin家族的其它成员，AFH14也是一个多结构域蛋白，位于N-端是一个phosphatase tensin-related domain（PTEN）结构域，包括1～394aa；一个富含脯氨酸的FH1结构域位于489～594aa，脯氨酸含量高达48％。从595～1033aa是一个序列和功能都保守的FH2结构域。通过与formin家族其它成员FH2结构域序列比对，发现AFH14与AFH17、AFH18的FH2结构域的同源性较高，分别高达52.14％和59.17％。而AFH17和AFH18的同源性高达83.02％。另外与formin家族其它成员拥有较多保守的氨基酸，在FH2结构域存在保守的G-N-X-M-N motif，只是II型formin的M被L所替换。在这个motif周围，也具备II型formin普遍存在的M-H-Y-L/Y-C-K motif。特别是与Bni1p的肌动蛋白结合和成核的K1 639、I 1431位点同源的氨基酸是保守的，K 1601仅被生化活性更强的R替换。这些保守序列暗示AFH14可能具有与Bni1p相似的微丝结合与成核能力3。

3 讨论

晶体结构和序列比对结果显示，所有的formin在C-端均有一个核心基序：M-H-Y-L/Y-C-K。在这个核心基序的附近II型formin包含一个G-NX-M-N基序［3］，与formin蛋白的二聚化有关。通过与Bni1p的FH2结构域比对，发现相对于Bni1p的K 1601、K 1639、I 1431是保守的微丝成核、正端封端与结合的位点［3］。AFH14这些基序和碱基都是保守的。只是K 1601的碱基被生物化学性质相似的R所替换，这个可能并不影响formin蛋白的微丝成核活性。AFH14也包含有与FH2结构域相邻的富含脯氨酸的FH1结构域，在TAIR的数据显示，该结构域比实验中所获得的序列要长，在预测和扩增得到的内含子与外显子交接处都存在5`GT和3`AG序列，推测可能是由于错误的评估了剪接位点的位置导致了CDS预测失误。FH1结构域中有48％的脯氨酸，与formin的FH1结构域中脯氨酸含量平均值41％相似，所以认为该结构域也是一个典型的FH1结构域。在N-端有一个典型的II型formin特有的PTEN结构域。首先与其它相类似的formin的PTEN序列进行比对，发现有40％～60％的相似性，另外和拟南芥的PTEN蛋白有20％相似性。对于该结构域类型的formin实验性研究很少，只有在moss的研究中发现与极性生长有关［4］。该类formin的报道大多是些生物信息学预测的知识。有文献认为AFH14的PTEN结构域与人的PTEN蛋白相似，但是保守的磷酸化位点T383被K替换，所以认为AFH14可能没有了磷酸化的功能，可能只在该蛋白定位中起作用，而与功能不相关。同时也有文献认为PTEN可能介导II型formin与膜性结构相互作用的调控。在拟南芥有3个PTEN相关蛋白，其中AtPTEN1在花粉中表达，缺失该基因导致花粉死亡［5］，AtPTEN2过表达导致雄性不育［6］。另也有文献认为PTEN类似于tensin，可能通过黏连微丝与质膜在信号通路中起作用。但是在我们的研究中发现PTEN可能与膜性结构的关系并不密切，更可能是与细胞周期中微管、微丝相关的，作用方式有可能是直接的也有可能是间接的。通过序列分析我们可以清晰地发现，AFH14是一个序列非常保守的II型formin。

［1］Bartolini F，Moseley J，Schmoranzer J，et al.The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity ［J］.J Cell Biol，2008，181（3）：523-536.

［2］Deeksm，Fendrychm，Smertenko A，et al.The plant formin AtFH4 interacts with both actin and microtubules，and contains a newly identified microtubule-binding domain［J］.J Cell Sci，2010，123（8）：1209-1215.

［3］Cvrcˇková F，Novotnym，Pícková D，et al.Formin homology 2 domains occur in multiple contexts in angiosperms［J］.BMC Genom.，2004，5（44）：44-61.

［4］Vidali L，Gisbergen P A C，Guérin C，et al.Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（32）：13341-13346.

［5］Gupta R，Ting J T L，Sokolov L N，et al.A tumor suppressor homolog，AtPTEN1，is essential for pollen development in Arabidopsis ［J］.Plant Cell，2002，14（10）：2495-2507.

［6］Sormani R，Pribat A，Rousseaum，et al.Over expression of a plant homolog of the human tumor suppressor PTEN leads to flower sterility［C］.20th international conference on Arabidopsis Research，2009，46.

〔编辑 杨德兵〕

Cloning and Sequence Analyzing of AFH14 Gene in Arabidopsis Thaliana

LI Yan-hua
（Institute of Brain Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

The study of the function and properties of formins from plant cell is quite limited.In this study，Arabidopsis FH14（AFH14）has been cloned，analyzed.To obtain the full-length ORF，we performed RT-PCR to amplify a cDNA encoding the entire sequence of AFH14.The gene was found to encode 18 exons and 18 introns，and to encode a 3 102-nucleotide mRNA with a single open reading frame estimated to produce a 113.6-kD protein of 1 033-amino acid residues.The AFH14 protein consisted of three functionally distinct subdomains：an N-terminal PTEN（phosphatase tensin）-related domain，a prorich FH1 domain，and a highly conserved C-terminal FH2 domain.

AFH14；Formin；PTEN；FH1；FH2

X703.5

A

1674-0874（2011）03-0048-03

2011-01-08

李艳花（1977-），女，山西应县人，博士，讲师，研究方向：细胞生物学。