黄 洋，靳 辉，吕丽华，张春香

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

GDF-8（Growth and Differentiation Factor-8）最早于1997年McPherron等[1]研究小鼠骨骼肌cDNA文库时发现，它是一种对骨骼肌生长具有负调控作用的细胞因子，该基因的突变或敲除会使动物生长速度加快、肌肉含量升高、脂肪含量减少。GDF-8基因发生自然突变的双肌牛——比利时蓝牛[2]，其肌肉数量比一般品种多20%，且肉质鲜嫩。因此，建立敲除GDF-8基因的转基因动物具有非常广阔的应用前景。

本研究分别用LipofectamineTM2000与Fu-Gene HD这2种转染试剂介导携带有绿色荧光蛋白基因标记的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞，探索其最佳转染效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表达载体与菌种 绿色荧光蛋白标记的GDF-8基因干扰质粒和大肠杆菌DH5α，为山西农业大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室保存。

1.1.2 试 剂 DMEM/F12（Boster），Opti-MEM，FBS（GIBCO），胰蛋白酶（Solarbio），双抗（Sigma），LipofectamineTM2000 （invitrogen），FuGene HD（Roche）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液配制 基本培养液：在DMEM/F12中添加10%FBS和1%双抗，此培养液用于绵羊成纤维细胞的原代培养和传代培养。无抗培养液：在DMEM/F12中添加10%FBS，此培养液用于质粒的转染。

1.2.2 绵羊成纤维细胞培养 取1周龄绵羊耳组织，用组织块贴壁培养法进行原代培养、传代培养和冻存，建立绵羊成纤维细胞系[3-7]，为质粒转染提供靶细胞。

1.2.3 转染

1.2.3.1 LipofectamineTM2000介导质粒转染绵羊成纤维细胞条件优化 将传至4代已经纯化的绵羊成纤维细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔。当细胞汇合至约70%时，将基本培养液换为无抗培养液，继续培养24 h，此时细胞汇合度已达到90%。

优化步骤：（1）将不同量的质粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6μg） 和不同量的 LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5μL）分别稀释于25μL的Opti-MEM中，然后将稀释好的质粒DNA和LipofectamineTM2000两两混合构成50μL转染液，进行转染，共16个处理。……