郭彩杰 侯丽霞 崔 娜 韩明利

（1山东省农业科学院蔬菜研究所，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，山东济南 250100；2沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110161）

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

郭彩杰1，2侯丽霞1*崔 娜2*韩明利2

（1山东省农业科学院蔬菜研究所，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，山东济南 250100；2沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110161）

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的 F2为材料，利用正交试验设计对 SRAP-PCR反应体系中的5因素（模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶）在4个水平上进行正交优化试验。结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为:模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol·L-1、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、Taq DNA 聚合酶1.0 U。

番茄；正交设计；优化；SRAP

相关序列扩增多态性（squence-related amplified polymorphism，SRAP）是由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quirost（2001）提出的一种基于PCR技术的新的DNA分子标记技术。SRAP具有简单、高效、高共显性、重复性好、易测序等优点，尤其可以检测基因的可译读码框（ORFs）区域，从而提高了扩增结果与表现型的相关性。目前SRAP标记已开始在植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学方面得到成功应用。

番茄（Lycopersion esculentumMill.）是一种喜温蔬菜，最适宜的生长温度是15～30 ℃。低温严重影响番茄的品质和产量。番茄的耐低温性是由多个基因控制的非常复杂的数量性状，也受环境因素的影响（Kharti et al.，1994）。近年来，对于番茄抗冷性状的选择正由传统的表型选择向DNA分子水平的基因直接选择发展。本试验采用正交试验设计的方法，建立番茄耐低温SRAPPCR的最优反应体系，为番茄耐低温分子标记及分子育种提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

据2007年露地栽培耐低温试验，抗寒0号和番青同时播种、定植，抗寒0号生长正常，番青全部死亡；据低温发芽试验，抗寒0号发芽正常，番青不发芽，表明抗寒0号耐低温，番青不耐低温。抗寒0号（♀）与番青（♂）由山东省农业科学院蔬菜研究所自主选育，将二者的F2于2009年9月播种在山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地日光温室中，幼苗生长4～5片叶时取样，提取叶片基因组DNA。Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。P1:5′TGAGTCCAAACCGGATA3′和P2:5′GACTGCGT ACGAA TTTGC3′为本试验正交试验设计方案中的固定引物。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 快捷型植物基因组DNA提取系统购自天根生化科技（北京）有限公司，紫外分光光度计及1.5 %琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度，并稀释到15 ng·L-1备用。

1.2.2 正交试验设计方案 采用正交设计L16（45）进行试验，设计模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶等5因素4水平（表1），3次重复。PCR反应体系20 μL，程序为:95 ℃5 min，94 ℃1 min，35 ℃1 min，72 ℃1 min，5个循环；94 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1 min，40个循环，72 ℃10 min，-4 ℃保存。产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，拍照，Bandscan软件分析图像，根据条带数目和背景依次给16个反应打分，条带最多的记为16，最少的记为1，3次重复分别计分（谢云海 等，2005）（表2），将得分的平均值输入DPS V7.05软件进行统计分析，分别得出5因素对PCR试验影响大小的值。

1.2.3 SRAP-PCR优化体系的验证 采用SRAP-PCR已优化的反应体系，用14对引物（表4）对耐低温材料抗寒0号、不耐低温材料番青DNA进行扩增，以验证该体系的效果。

2 结果与分析

表1 PCR体系的因素水平

2.1 电泳结果评分

按照表2设计的16个反应进行PCR试验，电泳的检测结果如图1所示，得分如表2所示，取3次重复得分平均值在假设不存在交互作用下进行直观分析。求各列各水平得分平均值的和（T1、T2、T3和 T4），各水平的平均值（、、和），用各列最大平均值减去最小平均值得极差R（表3），极差越大说明该因素对反应结果影响越大。分析极差R可知，引物对反应结果影响最大，Mg2+对反应结果影响最小，各因素对反应结果的影响大小依次:引物＞TaqDNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。

表2 PCR正交试验设计表L16（45）

2.2 各因素对PCR结果的影响

2.2.1 引物浓度对PCR结果的影响 PCR反应中引物浓度影响PCR扩增特异性效果（表3），PCR引物浓度在0.25 μmol·L-1和0.50 μmol·L-1时对PCR结果的影响差异不大，PCR反应得分平均值均较低（、），0.75 μmol·L-1水平与各水平差异较大。表明0.75 μmol·L-1为体系引物浓度的最佳条件。

表3 PCR正交试验得分统计分析结果

表4 SRAP引物组合序列

2.2.2TaqDNA聚合酶对PCR结果的影响TaqDNA聚合酶量是影响PCR反应的一个重要因素（表3）。本试验体系中TaqDNA聚合酶量为0.5 U时，PCR反应得分平均值偏低；TaqDNA聚合酶量为1.0 U和2.0 U时，PCR反应得分平均值（和）相差不大。TaqDNA聚合酶价格较高，在确保稳定的情况下，选择TaqDNA聚合酶量1.0 U为最佳反应条件。

2.2.3 dNTPs对PCR结果的影响 dNTPs是PCR的反应原料，一般浓度范围为0.05～0.20 mmol·L-1。本试验中随着dNTPs浓度的增高，PCR反应得分平均值呈下降趋势，dNTPs最佳浓度为0.125 mmol·L-1（表3）。

图1 PCR产物电泳图

2.2.4 模板DNA对PCR结果的影响 模板DNA的用量和纯度对PCR的结果有着重要的作用，它对产物的产量和特异性都有影响。本试验中，随着模板DNA浓度的升高，PCR反应得分平均值呈下降趋势（表3）。在保证扩增条带清楚的条件下，应尽量减少模板DNA的用量。所以本试验中模板DNA用量15 ng应为最佳反应量。

2.2.5 Mg2+浓度对PCR结果的影响 Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有明显的影响。随着Mg2+浓度增大，PCR反应得分平均值逐渐升高，当Mg2+浓度超过2.5 mmol·L-1时，得分平均值开始下降，Mg2+浓度在2.0、2.5 mmol·L-1时，PCR反应得分平均值相差不大（表3），从节约的角度选择2.0 mmol·L-1Mg2+作为体系的最佳浓度。

2.3 SRAP-PCR优化反应体系的验证结果

采用SRAP-PCR已优化的20 μL反应体系（模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol·L-1、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U），以14对引物对番茄不耐低温、耐低温材料用2.0 mmol·L-1的DNA进行扩增，以验证该体系的效果。从图2中可以看出，利用SRAP-PCR优化体系进行 PCR扩增，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，结果条带清晰、多态性较丰富。

图2 SRAP-PCR产物电泳验证图

3 结论与讨论

刘立军等（2006）认为不同植物的SRAP-PCR反应体系是不同的，建立一个特定试验条件下适合该植物的最佳SRAP-PCR反应体系可为SRAP分子标记提供良好的基础。本试验获得的番茄耐低温SRAP-PCR反应体系中，20 μL的最佳反应体系:模板DNA15 ng、引物浓度0.75 μmol·L-1、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。此最佳体系与正交设计表中得分最高的编号为5和16的反应大部分相似。王燕等（2007）对番茄基因组DNA的SRAPPCR反应体系进行优化，得到的最佳反应体系为:Mg2+浓度为1.5～3.0 mmol·L-1，模板DNA为10～20 ng（每10 μL体系）、引物浓度为0.25 μmol·L-1、dNTPs浓度为0.05～0.20 mmol·L-1。李晓慧等（2008）对西瓜SRAP-PCR反应体系的优化结果为:20 μL体系中，模板DNA为100 ng、引物浓度60 ng、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.3 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U。本试验通过正交试验设计确立了番茄耐低温的SRAP-PCR反应体系中各因素的最佳具体浓度，同西瓜SRAPPCR反应体系相比有一定的差异，表明不同植物间的SRAP-PCR反应体系存在明显差异；同王燕等（2007）对番茄基因组DNA的SRAP-PCR反应体系相比有细微的差异，表明同一作物在不同品种间也会存在不同。番茄耐低温的SRAP-PCR反应体系的确立是在标准SRAP-PCR的基础上增加5个循环，在琼脂糖凝胶电泳上进行的，最佳反应体系存在丰富的扩增条带，此方法简单快捷，为SRAP分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳提供了依据，利用本优化体系进行PCR扩增，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，结果是条带清晰、多态性较丰富。此方法也为番茄耐低温育种提供了重要的辅助方法。

谢云海，夏德安，姜静，林萍.2005.利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系.分子植物育种，3（3）:445-450.

王燕，龚义勤，赵统敏，刘广，郁樊敏，叶海龙，柳李旺.2007.番茄SRAP-PCR体系优化与品种分子鉴定.南京农业大学学报，30（1）:23-29.

李晓慧，王从彦，徐小利，常高正，张四普.2008.西瓜SRAP-PCR反应程序的建立与体系优化.华北农学报，23（3）:38-41.

刘立军，蒙祖庆，邢秀龙，彭定祥.2006 .苎麻基因组SRAP扩增体系的优化研究.分子植物育种，4（5）:726-730.

Li G，Quiros C F.2001.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica.Theor and Appl Genet，103（2）:455-461.

Kharti V G，Polesskaya L M，Zhakoteh A G.1994.Comparative evaluation of genetic organization of quantitative cold-resistance traits of tomato（Lycopersicon esculentum L. hirsutum）during germination and the early vegetative stage.Genetika，30（4）:502-508.

Optimization of SRAP-PCR System for Tomato Based on Orthogonal Design

GUO Cai-jie1,2, HOU Li-xia1*, CUI Na2*, HAN Ming-li2
（1Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Key Lab for Biology of Greenhouse Vegetable of Shandong Province, National Center for Vegetable Improvement（Shandong）, Jinan250100, Shandong, China;2Biological Science and Technology College, Shenyang Agricultural University, Shenyang110161, Liaoning, China）

The orthogonal design was used to optimize SRAP-PCR amplification system at4 levels of5 factors in tomato（Lycopersion esculentum Mill.）（DNA template, primer, Mg2+, dNTPs and Taq DNA polymerase）. The results showed that the order of each factor in different levels affected the result of PCR was: primer＞Taq DNA polymerase＞dNTPs＞DNA template＞Mg2+. The most suitable SRAP-PCR reaction system for tomato was total20 μL containing15 ng DNA template,0.75 μmol·L-1primer,2.0 mmol·L-1Mg2+,0.125 mmol·L-1dNTPs and1.0 U Taq DNA polymerase.

Tomato; Orthogonal design; Optimization; SRAP

S641.2

A

1000-6346（2011）02-0048-05

2010-09-06；接受日期:2010-10-20

国家“863”计划项目（2006AA100108-3-1），辽宁省教育厅科学技术研究项目（2008623）

郭彩杰，女，硕士研究生，主要从事植物发育分子生物学的研究，E-mail:guocaijie@163.com

*通讯作者（Corresponding authors）:侯丽霞，博士，副研究员，主要从事番茄育种与分子生物学研究，E-mail:houlx2006@126.com

崔娜，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物发育分子生物学研究，E-mail:syaua@163.com