王柏欣 陈 梅 王淑秋 王 昕 陈廷玉 王景涛 徐 辉 邱洪斌

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

他汀类药物可竞争性抑制胆固醇合成酶系中的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，使胆固醇合成受到限制。最近，实验发现辛伐他汀能减轻脑缺血再灌注损伤〔1〕，其机制尚未完全阐明。本文在制造大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的基础上，探讨辛伐他汀抗脑缺血再灌注损伤作用是否与抑制脑缺血再灌注损伤后细胞色素C以及线粒体游离钙的释放有关，为扩大辛伐他汀的临床用途提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，随机分为正常组、假手术组、模型组、辛伐他汀组。模型组和辛伐他汀组都应用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，缺血时间为 30 min，再灌注时间分别为 1、2、3、5、7 d，每个时间点 6 只大鼠。辛伐他汀组在术后第1天开始，予辛伐他汀20 mg/kg灌胃，假手术组及缺血再灌注组用相同体积的等渗盐水灌胃，正常组正常喂养。

1.1.2 试剂 辛伐他汀，浙江京新药业股份有限公司提供;大鼠细胞色素C酶联免疫检测试剂盒，上海西塘生物试剂公司提供;钙测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 建立脑缺血再灌注模型 根据大脑中动脉栓塞法〔2〕制备脑缺血再灌注模型。予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，将动物仰卧位固定(上门齿、四肢远端用粗线固定于鼠板上)，碘伏消毒颈部皮肤，颈部正中切口，分离出颈总动脉、颈外动脉以及颈内动脉，分别接扎颈总动脉及颈外动脉，在颈总动脉距离分叉处将尼龙线导入颈内动脉，插入线栓深度约为(18.0±0.5)mm，感到轻微阻力时立即停止插线。然后缝合伤口，留置线头于体外，30 min后将线拴提至颈总动脉内，完成再灌注。术后将室温控制在25℃ ～30℃，根据动物状况注射速尿或抗生素预防脑水肿和感染。假手术组除进线1.5 mm外，其余处理相同。辛伐他汀组在模型制作成功后，在术后第1天开始给药。

1.2.2 大鼠神经功能Longa评分〔2〕无神经功能缺失症状，活动正常者，计0分;不能完全伸展对侧前爪，计1分;动物爬行时出现向右转圈(追尾现象)，计2分;身体向偏瘫侧倾倒者，计3分;不能自发行走，意识丧失者，计4分。评分为0分和4分者均被剔除，神经功能评价在取材前进行。

1.2.3 脑组织匀浆的制备 取大鼠，10%水合氯醛麻醉，断头取脑，取手术侧半脑，在冰生理盐水中仔细剥离脑膜和血管，剪碎，清洗残血，冲洗至冰生理盐水无色澄清，吸水纸吸去多余水分，称重，剪碎，按称重量的9倍量取生理盐水(4℃)，玻璃匀浆器制备成10%脑组织匀浆。

1.2.4 脑组织线粒体游离钙含量的测定 取制备好的10%的组织匀浆，低温离心2 000 r/min，10 min，放弃沉淀，取上清液以10 000 r/min低温离心15 min，沉淀物为线粒体。采用甲基百里香酚蓝比色法测定钙离子的含量，严格按照说明书中的步骤操作。

1.2.5 脑组织细胞色素C含量的测定 取10%的脑组织匀浆，低温3 500 r/min离心，10 min，取上清液。酶联免疫吸附法(ELISA)测定脑组织匀浆上清液中细胞色素C含量，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 辛伐他汀对细胞色素C含量的影响 正常组及假手术组细胞色素C表达很少，而且正常组与假手术组之间无明显差异。模型组及辛伐他汀组细胞色素C表达明显增加，与假手术组比较具有统计学差异(P＜0.05)。而且在相同时间段，辛伐他汀组与模型组比较，细胞色素C的含量明显减少，具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 各组线粒体游离钙表达比较 正常组及假手术组线粒体游离钙有基础表达，模型组与辛伐他汀组在缺血再灌注后1 d时表达量最高，随着再灌注时间的延长其表达量减少。与假手术组比较，模型组的钙离子含量增高，而且具有显著性差异(P＜0.05);在相同时间点，与模型组比较，辛伐他汀组线粒体游离钙显著减少，具有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

表1 各组细胞色素C表达比较(±s，n=6，mmol/L)

表1 各组细胞色素C表达比较(±s，n=6，mmol/L)

与假手术组比较:1)P﹤0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;下表同

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表2 各组线粒体游离钙表达比较(±s，n=6，mmol/gprot)

表2 各组线粒体游离钙表达比较(±s，n=6，mmol/gprot)

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3 讨论

细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动的死亡方式，受细胞内、外因子调控的生理学过程。在脑缺血再灌注的中心区，由于血液供给急剧减少，细胞能量供给匮乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，导致大多数细胞肿胀、坏死。而在缺血半暗带区由于有侧支循环供血，缺血程度较缺血中心区轻，存在部分能量供应，则细胞损害相对较轻且进展慢。再灌注损伤可产生钙离子失衡，内质网和线粒体功能异常，过氧化作用增强等，这些均可以导致DNA损伤，后者如不能及时修复，积累到一定程度，则可通过启动凋亡程序，引起细胞凋亡，并随再灌注时间的延长，DNA损伤的积累，凋亡细胞亦不断增加〔3〕。研究表明，神经元凋亡在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用〔4〕，凋亡神经元的多少决定着缺血引起的损害最终范围大小。脑缺血再灌注和细胞凋亡关系密切，前者通过能量代谢障碍、氧应激和钙超载等导致细胞凋亡;而后者同坏死一起，参与缺血-再灌注后细胞的丧失。在缺血再灌注的过程中，脑组织产生的氧自由基、细胞内钙超载和线粒体损伤均可诱发神经细胞的凋亡。

线粒体损伤在脑缺血再灌注神经元损伤中扮演了关键的角色〔5〕，主要是通过调控细胞凋亡而促进脑缺血再灌注损伤。线粒体在细胞存亡机制，主要有两方面作用，①由于线粒体膜间隙的细胞色素C释放至胞质后触发caspase级联，导致细胞死亡;②线粒体外膜上的Bcl-2蛋白家族调控细胞色素C自线粒体释放，因此，细胞色素C在介导细胞凋亡发生的过程中发挥着重要的作用。细胞内钙作为第二信使、代谢调节因子和膜稳定剂在细胞正常机能活动中起重要作用。生理情况下，钙在细胞内外存在很大的浓度差，这依赖于细胞膜正常通透性及胞浆钙离子外排机制来维持，后一过程需消耗能量。脑缺血缺氧时主要由于ATP供应不足、NMDA受体过度兴奋介导与其耦联的钙通道开放、膜通透性增大及封阻机制障碍而致细胞外钙内流增加、胞浆钙外排障碍，造成细胞内钙离子浓度增高〔6〕。

钙超载时，一方面刺激线粒体钙泵摄钙，使胞浆内钙向线粒体转移，过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合成不溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少;另一方面，细胞内游离钙增加，激活多种钙依赖性降解酶，导致基质水解，损伤细胞。细胞内钙超载会引起神经元功能和结构完整性破坏，导致细胞死亡或凋亡。而且现在研究表明，Ca2+可能是造成脑缺血损伤各种因素最后作用的共同通路〔7〕。

因此，钙离子超载以及细胞色素C的释放在介导细胞凋亡的过程中具有重要的意义。本实验结果显示:辛伐他汀可以明显地降低脑缺血再灌注损伤后细胞色素C以及线粒体钙的含量。推测辛伐他汀具有抑制细胞凋亡的作用，而且其机制可能与抑制损伤后过度表达的细胞色素C以及线粒体钙有关，但具体的机制还有待于进一步研究。

1 Tobert JA.Simvastatin and beyond:the history of the HMG-CoA reducate inhibitors〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2003;2(7):517-26.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

3 Anagrama T，LAN J，Henshall DC，et al.Induction of oxidative DNA damage in the peri-infarct region after permanent focal cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem，2000;75(4):1716-28.

4 Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons〔J〕.Physiol Rev，1999;79(4):1431-568.

5 Cao G.Mitochondrial apoptotic signaling pathway in ischemic neuronal death〔J〕.Cereb blood Flow Metab，2001;21:321-33.

6 Honde HM，Korge P，Weiss JN.Mitochondria and ischemia/reperfusion injury〔J〕.Ann NY Acad Sci，2005;1047:248-58.

7 陈 敏，李长青.钙与脑缺血再灌注后神经细胞凋亡〔J〕.脑与神经疾病杂志，2003;11(4):253-5.