刘馨莲，李淑蓉，殷 舞，孙 静

(1成都医学院，成都 610083;2广西壮族自治区人民医院)

细胞增殖调控异常与肿瘤的发生密切相关，DNA复制起始调控在细胞增殖调控中占核心地位。2007年8月～2009年4月，我们采用免疫组化法检测脑胶质瘤组织中微小染色体维持蛋白5(MCM5)［1，2］、细胞增殖相关核蛋白(Ki-67)的表达，旨在进一步探讨脑胶质瘤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择广西壮族自治区人民医院手术切除的脑胶质瘤组织44份(肿瘤组)，男25例，女19例;年龄4～73岁，平均36.8岁。术后均经病理确诊，且术前未行放化疗。根据2000年WHO神经系统肿瘤分类标准，Ⅰ级8例，Ⅱ级12例，Ⅲ级11例，Ⅳ级13例。另选同期因颅脑损伤行颅内减压术手术切除的正常脑组织6份(正常组)，两组一般资料无统计学差异。主要试剂:MCM5单克隆抗体(Neomakers Fremont公司)，鼠抗人Ki-67单克隆抗体与SP试剂盒(北京中杉生物试剂公司)，DAB试剂盒(福州迈新公司)。

1.2 MCM5、Ki-67表达检测 采用免疫组化 SP法。全部标本均经10%中性甲醛固定，普通石蜡包埋，4 μm连续切片，DAB显色。石蜡切片脱蜡水化后，微波抗原修复，过氧化酶阻断剂灭活内源性过氧化物酶活性，羊血清工作液封闭，滴加一抗4℃过夜，滴加生物素标记的二抗，滴加链亲和素一过氧化物酶溶液。DAB显色，苏木精复染。用已知阳性组织切片为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断标准:MCM5和Ki-67的阳性细胞均为细胞核呈棕黄色。计算MCM5和Ki-67的标记指数(LI):选取10个阳性细胞最密集、背景最清晰区域，每个区域高倍视野下计算100个细胞中的阳性细胞数，计算1000个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比，取其平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。所有数据以表示，两均数比较用t检验，相关分析采用Spearman等级相关分析法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MCM5、Ki-67表达 肿瘤组、正常组MCM5的LI分别为 12.96 ±8.49、0，P ＜0.05;Ki-67 的 LI分别为 10.09 ±7.07、0，P ＜0.05。

2.2 MCM5、Ki-67表达与脑胶质瘤临床病理特征的关系 见表1。

表1 MCM5、Ki-67的LI与脑胶质瘤临床病理特征的关系(LI，)

表1 MCM5、Ki-67的LI与脑胶质瘤临床病理特征的关系(LI，)

临床病理特征 n MCM5 Ki67 P值性别男25 12.94 ±7.96 10.15 ±6.78 ＞0.05女19 13.00 ±9.37 10.00 ±7.62年龄(岁)＜40 22 7.87 ±5.14 5.70 ±3.60 ＞0.05≥40 22 18.06 ±8.18 14.47 ±7.01恶性程度Ⅰ级 8 3.70 ±1.53 3.11 ±1.41Ⅱ级 12 9.17 ±3.15 6.76 ±2.59 ＜0.05Ⅲ级 11 15.49 ±7.41 12.23 ±6.68Ⅳ级13 20.03 ±8.40 15.64 ±7.31

2.3 相关性分析 脑胶质瘤组织中MCM5与Ki-67 表达呈正相关(r=0.990，P ＜0.01)。

3 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞周期密切相关，而细胞周期又与DNA复制的起始调控相关。微小染色体维持蛋白家族是一组与DNA复制和细胞增生密切相关的蛋白家族［1］。目前证实MCM家族由MCM2、MCM3、MCM4(Cdc21)、MCM5(Cdc46)、MCM6(Mis5)和MCM7(Cdc47)6个亚单位组成，具有解链酶活性［3］，是真核生物DNA复制的主要调控因子。MCM蛋白与细胞周期密切相关，是启动真核细胞DNA复制，调控细胞由G1期进入S期的关键蛋白［4］。在细胞周期中，MCM蛋白的表达在G1/S期达到峰值，细胞进入G0期和分化衰老时，MCM表达水平下降甚至不能测得，此特点使其成为反映细胞增殖活性的特异指标。Osaki等［5］研究表明，MCM蛋白能够敏感而特异的反映细胞的增殖情况，在判断肿瘤的恶性程度和评估预后方面具有重要意义。MCM5是MCM家族成员之一，其在静止期的细胞中很少表达，在肿瘤组织细胞中大量表达，MCM5蛋白表达阳性是细胞具有增殖能力的标志，可作为肿瘤细胞增殖的标志［6］。

Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，存在于细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期，是目前应用最为广泛的增殖细胞标记之一［7］。研究显示，Ki-67并非细胞增殖所必需的因子，其G1早期并无表达，而是在核糖体生物合成过程中发挥作用［8］，且Ki-67表达易受细胞外因素影响(如细胞的营养状态)。因此，Ki-67可能仅能鉴定部分增殖细胞［9］。

本研究结果显示，肿瘤组MCM5、Ki-67的LI明显高于对照组，提示MCM5和Ki-67对区分正常脑组织和脑胶质瘤组织有一定参考价值;MCM5、Ki-67阳性表达与脑胶质瘤恶性程度密切相关，且随恶性程度升高而升高，说明随着肿瘤恶性程度的增加，有越来越多的细胞进入了增殖周期。可见MCM5和Ki-67蛋白表达水平可直接反映细胞的增殖活性。肿瘤组MCM5与Ki-67表达呈正相关，提示MCM5和Ki-67在标记具有增殖活性的肿瘤细胞中具有相同的意义;在各级肿瘤中MCM5的表达均高于Ki-67的表达，原因可能是处于G1早期的细胞无Ki-67的表达，而MCM5的表达在G1/S期达到峰值，说明MCM5不但能够检测增生活跃的细胞，还能检测具有增生潜能的细胞［1］，MCM5是一种更为灵敏的增殖标志。

综上所述，MCM5、Ki-67高表达在脑胶质瘤发生、发展中起重要作用。MCM5表达能更好的反映肿瘤细胞的增殖活性，具有潜在的临床应用价值。

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