李文媛，王 莹，李明秋

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，占耳鼻咽喉科恶性肿瘤的7.9% ～35.0%。血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)是淋巴管生成因子VEGF-C和VEGFD的特异性受体，不仅能促进淋巴管生长，还能充分保护淋巴管内皮细胞，避免其凋亡，并诱导淋巴管内皮细胞增殖和迁移［1］。2004年1月～2009年3月，我们分别检测了VEGFR-3蛋白、VEGFR-3 mRNA的表达，旨在为喉癌的诊治研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 选取中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科手术切除的原发性喉癌组织标本45份(喉癌组)，患者男43例，女2例;年龄41～86岁，中位年龄63.5岁;年龄≤60岁18例，＞60岁27例。均经病理证实，无远处转移，术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗;其中声门型23例，声门上型17例，声门下型5例;肿瘤分化程度高分化29例，中分化12例，低分化4例;TNM分期为Ⅰ、Ⅱ期14例，Ⅲ、Ⅳ期31例。有颈部淋巴结转移15例;有淋巴管浸润8例。另选20份正常喉良性病变组织标本(良性组)作为对照。两组一般资料无统计学差异。试剂:兔抗人VEGFR-3多克隆抗体及SP试剂盒，抗β-actin抗体，Trizol试剂、SuperscriptⅡ反转录酶、dNTPs，TaqDNA 聚合酶、DL2000DNA 标志物，VEGFR-3引物。

1.2 VEGFR-3表达检测 ①VEGFR-3蛋白:所有标本均经石蜡切片常规脱蜡至水，0.5%过氧化氢孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后滴加稀释后的一抗VEGFR-3(1∶100)。4℃过夜。滴加生物素标记体，30 min，37℃。滴加过氧化物—链霉素卵白素37℃，30 min。DAB显色液显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。随机选取5个高倍视野按阳性细胞比例及着色程度计分，行半定量分析。结果判断标准:VEGFR-3表达阳性为棕黄色，位于细胞膜或细胞质。无着色细胞计为0分，着色细胞比例≤1/3计为1分，1/3～2/3计为2分，＞2/3计为3分。浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。两项乘积判断阳性结果，两项乘积≤3分为阴性，＞3分计为阳性。②VEGFR-3 mRNA:取各项新鲜组织50 mg(喉癌组及良性组各6例)，采用Trizol法提取总RNA并行纯度鉴定。以OLIGO六聚体为逆转录引物，以提取的总RNA为模板，在AMV催化下反转录出cDNA，实时荧光定量PCR法测定VEGFR-3的相对表达量。依据标准定量曲线对PCR产物定量分析，通过2ΔΔCt方法进行相对定量，分析VEGFR-3表达与喉癌临床病理参数的关系。

1.3 VEGFR-3表达与喉癌预后的关系 生存资料通过信访或电话获得，生存期开始时间自手术日期始，至2009年6月1日止，其中2例失访。生存期计算以月为单位，未满整月以实际生存天数计算。随访期限为3～71个月，中位31月。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，死亡病例均由复发或转移引起。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计数资料采用 χ2检验，VEGFR-3 mRNA比较采用 t检验，生存曲线差异性采用Log-rank法检验。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 VEGFR-3表达 喉癌组及良性组 VEGFR-3蛋白阳性率分别为 44.4%、15.0%，P ＜0.01。喉癌组及良性组VEGFR-3 mRNA相对表达量分别为10.4 ±2.7、2.3 ±0.6，两组比较 P ＜0.01。VEGFR-3表达与喉癌临床病理参数的关系见表1。

表1 VEGFR-3表达与喉癌临床病理参数的关系

2.2 VEGFR-3表达与喉癌患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析结果提示，VEGFR-3阳性表达者平均生存时间为50个月，阴性表达者平均生存时间为60个月，Log-rank检验表明VEGFR-3阳性表达与生存曲线不相关(P=0.445)。

3 讨论

在成体组织中VEGFR-3几乎只特异表达于淋巴管内皮细胞上。Stacker等［2］在小鼠模型中发现，VEGF-C和VEGF-D可以与VEGFR-3结合，诱导肿瘤组织周围的淋巴管扩张和肿瘤内部形成新生淋巴管。表达可溶性VEGFR-3-lg融合蛋白可以阻断此信号传导，从而抑制肿瘤相关的淋巴管生成。研究发现，在食管癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌中，VEGFR-3表达与肿瘤组织淋巴管增加、淋巴结的转移显著相关［3］。本研究发现，喉癌组 VEGFR-3、VEGFR-3 mRNA表达均显著高于良性组，提示VEGFR-3可能在喉癌的发病过程中发挥一定作用。本文还发现，喉癌组VEGFR-3表达与喉癌淋巴结转移和淋巴管浸润显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、TNM分期无相关性，我们推测VEGFR-3在喉癌淋巴结转移和浸润过程中发挥重要作用。

目前，关于VEGFR-3对肿瘤预后影响的报道尚不多见，且争议较多。Juttner等［4］报道胃癌的3年生存率与VEGFR-3表达有关，VEGFR-3是胃癌独立的预后不良因素;研究认为，VEGFR-3表达程度

与肺癌的预后无关［5］。Baek等［6］认为高淋巴管密度(LVD)是喉癌淋巴结转移和复发的预后因子，而Hinojar-Gutiérrez等［7］则认为低 LVD 是独立的喉癌淋巴结转移的预后因素。研究结果显示，VEGFR-3阳性表达与喉癌患者的生存曲线无明显相关性。因VEGFR-3主要局限于淋巴管内皮细胞表达，是淋巴管内皮细胞特异的分子标志物，可以用于检测LVD，所以我们认为LVD不能独立作为喉癌整体生存率的预后因子。但此研究仅是针对一组有限喉癌患者数量的回顾性研究，结论仍需进一步证实。

［1］Hsu JY，Wakelee HA.Monoclonal antibodies targeting vascular endothelial growth factor:current status and future challenges in cancer therapy［J］.BioDrugs，2009，23(5):289-304.

［2］Stacker SA，Baldwin ME，Achen MG.The role of tumor lymphangiogenesis in metastatic spread［J］.FASEB J，2002，16(9):922-934.

［3］Achen MG，Stacker SA.Molecular control of lymphatic metastasis［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，(1131):225-234.

［4］Juttner S，Wissmann C，Jons T，et al.Vascular endothelialgrowth factor-D and its receptor VEGFR-3:two novel independent prognostic markers in gastric adenocarcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(2):228-240.

［5］Debinski W，Slagle-Webb B，Achen MG，et al.VEGF-D is an X-linked/AP-1 regulated putative onco-angiogen in human glioblastoma multiforme［J］.Mol Med，2001，7(9):598-608.

［6］Baek SK，Jung KY.Prognostic significance of vascular endothelial growth factor-C expression and lymphatic vessel density in supraglottic squamous cell carcinoma［J］.Laryngoscope，2009，119(7):1325-1330.

［7］Hinojar-Gutiérrez A，Fernández-Contreras ME，González-González R ，et al.Intratumoral lymphatic vessels and VEGF-C expression are predictive factors of lymph node relapse in T1-T4 N0 laryngopharyngeal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2007，14(1):248-257.