郑培实，张 阳，蒋 葵，戴朝霞，徐丽叶，方立萍，丁晓蕾

(大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连 116027)

肝癌是常见恶性肿瘤，近年来病死率呈逐年上升趋势，对于晚期肝癌，缺少有效的药物治疗方案［1］。2010年3～10月，我们观察了华蟾素对离体肝癌细胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影响，旨在为肝癌的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所细胞库);华蟾素注射剂(安徽金蟾制药厂);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 培养环境为37℃、5%CO2孵箱，使用10%胎牛血清(57℃灭活30 min)、青链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养液。细胞为上皮样贴壁细胞，每3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于试验。

1.2.2 华蟾素干预及细胞增殖抑制率检测 取对数生长期SMMC-7721细胞接种于96孔板，密度为7×103/孔，培养24 h。实验组分别加入0.4、0.6、0.8 μmol/L华蟾素，每药物浓度各设5个复孔，对照组不加药。加药后分别培养24、48 h后，各孔加5%四氮唑蓝液10 μl，孵育4 h，洗涤后各孔加二甲亚砜200 μl，充分混匀溶解，酶标仪测定570 nm波长处各孔的D值，计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组D570值 -实验组 D570值)/对照组 D570值 ×100%。

1.2.3 华蟾素干预及细胞凋亡率检测 取对数生长期的SMMC-7721细胞接种于6孔板，培养24 h后实验组加入华蟾素，使其终浓度为0.6 μmol/L，对照组不加药。离心去培养基，PBS洗涤后，采用Annexin V-FITV/PI双标记的流式细胞术避光室温标记30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 华蟾素干预及细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA检测 分组及干预同1.2.3，药物作用48 h后收集5×106/ml细胞于离心管中，离心去上清液;加入Trizol试剂，按说明书操作步骤提取RNA。采用RT-PCR法(凯基公司的RT-PCR反应体系)检测Caspase-3 mRNA相对表达量。

1.2.5 华蟾素干预及测Mcl-1蛋白检测 采用Western blot法。分组及干预同1.2.3。药物作用48 h后收集细胞提取总蛋白。以tubulin为内参照，结果用Leica Qwin图像分析软件分析条带光密度积分值。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率 见表1。

表1 两组细胞增殖抑制率比较(%)

2.2 细胞周期及凋亡率 见表2。

表2 两组细胞周期所占比例及凋亡率比较(%，)

表2 两组细胞周期所占比例及凋亡率比较(%，)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 G0～G1期 G2～M期 S 期 凋亡率实验组 55.53 ±0.75 1.32 ±0.19 41.54 ±0.5417.26 ±0.89*对照组63.21 ±1.2410.21 ±0.13 24.33 ±1.453.21 ±0.43

2.3 Caspase-3 mRNA及Mcl-1蛋白表达 华蟾素作用48 h后，实验组Caspase-3 mRNA分别为(0.54±0.10)%、(0.32 ±0.11)%，P ＜0.05;Mcl-1 蛋白分别为(0.60 ±0.14)%、(0.95 ±0.11)%，P ＜0.05。

3 讨论

蟾蜍治疗肿瘤有着悠久的历史和丰富的文献记载，目前用于多种肿瘤［2，3］，有研究提示其可能通过干预FAS通路发挥抗肿瘤作用［4］。但其在Mcl-1为中心的凋亡通路中发挥的作用尚不明确。本研究实验组增殖抑制率明显高于对照组，且呈时间和剂量依赖性，提示华蟾素作用于SMMC-7721离体细胞，可抑制其增殖，并且诱导其凋亡。

Caspase是一个含有半胱氨酸活性的胞质蛋白酶家族，迄今至少发现14个成员。Caspase-3是目前发现的细胞凋亡过程中激活的关键酶，也是细胞凋亡的主要效应分子［5］。其作用之一是参与Mcl-1蛋白的降解［6，7］，而后者通过特定信号通路抑制细胞凋亡、调节细胞周期，其过表达可以促进恶性肿瘤细胞生存，可引起在人类的造血系统的肿瘤以及多种实体瘤，其亦是肿瘤对传统的治疗耐药的一个关键因素。Mcl-1即髓系白血病基因，在细胞的生长和分化过程中是一个必要的抗凋亡因子，调节其表达的信号传导通路中的任何一个环节出现调节紊乱都会引起Mcl-1的过度表达，从而导致包括肿瘤在内人类一些疾病的发生。Mcl-1过表达可引起包括肝癌在内的多种实体瘤［8］，并且是肿瘤对传统的治疗耐药的一个关键因素［9］。

本研究实验组Caspase-3 mRNA表达量明显高于对照组，Mcl-1蛋白表达量明显低于对照组，说明华蟾素对SMMC-7721离体肝癌细胞具有增殖抑制及凋亡诱导作用，其机理可能为使Caspase-3表达升高、Mcl-1表达降低。本研究为华蟾素治疗肝癌提供了更深入的理论依据。

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［5］王新艳，李玉华，朱谥豢，等.卵巢癌组织KLKⅡ基因的表达意义［J］.第四军医大学学报，2006，27(22):2023-2025.

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［8］Derenne S，Monia B.Antisense strategy shows that Mcl-1 rather than Bcl-2 or Bcl-x(L)is an essential survival protein of human myeloma cells［J］.Blood，2002，100(1):194.

［9］Hussain SA，Cheney CM.Mcl-1 is a relevant therapeutic target in acute and chronic lymphoid malignancies:down-regulation enhances rituximab mediated apoptosis and complement-dependent cytotoxicity［J］.Clin Cancer Res，2007，13(7):2144.