张 萌，袁乃芬，刘 巍

(河北医科大学第四医院，石家庄 050011)

视网膜母细胞瘤(RB)是儿童常见的眼内原发恶性肿瘤，严重威胁患儿的视力和生命。凋亡抑制蛋白(Livin)是2000年由科学家在人基因组库中筛选克隆出的一种新型、有较强抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成员，能够与凋亡蛋白酶结合，抑制其介导的细胞凋亡［1，2］。2000年1月 ～2010年12月，我们采用Max-VisionTM快捷免疫组化法检测RB中Livin的表达情况，旨在进一步了解其在RB发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选择我院手术切除的RB组织标本43份(肿瘤组)，其中男23例，女20例;年龄9个月～8岁，平均3.35岁。所有患儿均经病理证实，且术前均未进行放化疗。按传统临床分期，眼内生长期21例，青光眼期13例，眼外扩展期9例;按照组织病理学分型，未分化型24例，分化型19例。另选外伤后眼球摘除的正常组织标本6份(正常组)，两组一般资料无统计学差异。主要试剂:兔抗人Livin多克隆抗体购自北京博奥森公司(bs-0738R)。主要仪器:Leica RM2135型切片机、Olympus BX41显微镜、Qcapture图像采集系统(加拿大Qimaging公司)。

1.2 Livin表达检测 所有标本均经甲醛固定，自动脱水，浸蜡，包埋，切片。苏木素—伊红(HE)染色按常规进行。免疫组化采用Max-VisionTM快捷免疫组化法。石蜡切片脱蜡和水化后，PBS(pH 7.4)冲洗3次，抗原修复后，3%过氧化氢室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶的活性，PBS冲洗3次，加入工作浓度1∶300的Livin抗体室温孵育2～3 h，PBS冲洗3次，加入二抗，室温下孵育20 min，PBS冲洗，最后DAB显色，中止反应后苏木素复染，脱水、透明、封片。以已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。阳性判定标准:Livin表达主要位于细胞质，以出现清晰的棕黄色颗粒作为阳性结果判定。每张切片随机选取10个不同高倍视野各计数100个细胞，按阳性细胞所占的百分比计分:≤5%计0分，6% ～25%计1分，26% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分;着色强度依据着色计分:无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕褐色为3分。上述两项相加＜2分为阴性，＞2分为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件，采用χ2检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Livin表达情况 两组Livin阳性表达率分别为62.79%、0，P ＜0.05。

2.2 Livin表达与RB临床病理特征的关系 见表1。

表1 Livin表达与RB临床病理特征的关系

3 讨论

恶性肿瘤的发生不仅与癌基因的激活和抑癌基因的突变或缺失有关，还与肿瘤凋亡的抑制有关。凋亡抑制是肿瘤细胞的一个重要特性，与肿瘤细胞无限增殖密切相关。IAPs是目前发现的惟一可以与半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)直接结合而起抑制作用的蛋白家族，其过度表达引起的凋亡不足与肿瘤发生密切相关。Livin又名KIAP/ML-IAP，2000年在人基因组库中筛选克隆出的一种新型、有较强抗凋亡功能的IAPs蛋白家族新成员。Livin基因定位于染色体20q13，全长4.6 kb，包含7个外显子及6个内含子，其基因转录产物有两种mRNA亚型，分别编码298个氨基酸蛋白质(α)和280个氨基酸蛋白质(β)，Livin蛋白N端包含1个BIR结构，C端含1个 RING环指结构［3］。研究发现，Livin在黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等肿瘤细胞中及胎盘、胚胎组织中表达，但在多数正常成人组织中不表达。这一表达的特异性使Livin基因成为目前国际研究的热点［4］。

Livin的高表达可能与肿瘤的形成和细胞增殖活跃密切相关［5］。本研究肿瘤组Livin阳性表达率明显高于正常组，提示Livin的高表达可能与RB的发生、发展有关。本研究发现Livin阳性表达与RB的组织分化程度有关，提示Livin的阳性表达不但与RB的发生有关，还可能与RB的恶性程度呈正相关，可能是预后不良的指征。可能机制:Livin的BIR区与Caspase结合，抑制Caspase活性，尤其是抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，从而阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径［6，7］。本研究还发现Livin阳性表达与RB临床分期无明显相关性，表明Livin表达可能与肿瘤的局部浸润生长无明显相关性，也可能因为本研究病例数较少，有待于大样本的研究做进一步评价。

总之，Livin表达上调在RB的发生、发展中起促进作用，可作为RB早期诊断及预后的指标之一，为RB的基因治疗提供新靶点。

［1］Hariu H，Hirohashi Y，Torigoe T，et al.Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，Livin/ML-IAP in lung cancer［J］.Clinical Cancer Research，2005，11(3):1000-1009.

［2］Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(MLIAP)［J］.J Biol Chem，2002，277(14):12275-12279.

［3］Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］.FEBS Lett，2001，495(1-2):56-60.

［4］Gazzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of livin，survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85-90.

［5］Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-Livin antibody in gastrointestinal cancer patients［J］.Clin Chem，2003，49(7):1206-1208.

［6］Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Biol，2000，10(21):1359-1366.

［7］Kasof GM，Gomes BC.Livin a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3238-3246.