高金梅，张敬伟

(天津医科大学第二医院，天津 300211)

2009年5～11月，我们对60例肥胖伴高脂血症患者载脂蛋白E(ApoE)基因多态性进行了检测，探讨两者的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择肥胖伴高脂血症患者60例(观察组)，男38 例，女22 例;年龄(53.3 ±7.1)岁。均符合高脂血症［空腹12 h血浆TG≥1.7 mmol/L和(或)TC≥5.7 mmol/L)及肥胖(超过标准体质量的20%)］诊断标准。另选健康体检者48例作为对照组，其中男29例，女19例;年龄(51.6±4.3)岁。两组血常规、尿常规、肝肾功能、电解质各项指标均在正常范围，心电图及腹部B超未发现严重疾病，一般资料无统计学差异。

1.2 ApoE基因多态性检测

1.2.1 DNA提取(血液) 加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000 r/min离心5 min，弃上清;加400 μl STE，10%SDS 40 μl，蛋白酶-K 10 μl(10 mg/ml);56℃水浴4 h;等体积饱和酚，倒转摇匀。12000 r/min离心5 min，吸上层入另一1.5 ml离心管;上清液加等体积的氯仿，倒转混匀。12000 r/min离心5 min，吸上层入另一1.5 ml离心管;上清液加等体积氯仿，倒转混匀10 min，12000 r/min 5 min，取上清入另一管;加1 ml 70%乙醇洗涤，12000 r/min低温(4℃)离心10 min，去上清，重复1次;自然干燥后，用pH 8.0 TE溶解，保存在-20℃备用。

1.2.2 人基因组DNA消化 用75%乙醇将DNA洗涤两次后于室温倒置晾干至DNA沉淀变白，根据沉淀量加入合适体积去离子水(10～50 μl)于37℃水浴过夜消化DNA。

1.2.3 聚合酶链式反应特异扩增 ApoE引物设计:5＇-AGAGAATTCGCCCCCGGCCTGGTACAC-3＇，5＇-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3＇，244 bp。PCR反应体系为 50 μl，其中包括 DNA 10 μl，Premix Taq 25 μl，50 pmol/L，上游引物 1.0 μl，50 pmol/L，下游引物 1.0 μl，DMSO 5.0 μl，dd H2O 8.0 μl。PCR 循环条件:97℃预变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共进行35个循环，最后72℃再延伸7 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.4 ApoE基因限制性酶切及银染 取2 μl扩增产物加入限制性内切酶 HhaⅠ 0.8 μl(5 U/μl)、1 μl酶切缓冲液及6.2 μl去离子水混合后于37 ℃水浴过夜消化。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶板固定于电泳装置上，冲洗梳孔，于4℃冰箱中200 V下先预电泳30 min，上样后继续电泳至溴酚蓝距离胶板下缘0.5 cm时停止电泳准备进行银染。固定液:无水乙醇100 ml+5 ml冰乙酸+895 ml蒸馏水;染色液:0.2%AgNO31000 ml;显色液:15 g NaOH+10 ml甲醛+990 ml蒸馏水。将凝胶放入预冷的固定液中固定15～20 min(避免晃动):蒸馏水冲洗干净后置于预冷的染色液中，轻微摇晃15～20 min使凝胶均匀上色;再用蒸馏水反复冲洗干净后放入显色液中，轻微摇晃使凝胶均匀染色，适时停影。根据泳带位置判断各样品ApoE基因型，照相记录结果或将凝胶干燥后进行保存。

1.3 血脂水平检测 采用全自动生化分析仪检测观察组基因频率较高的血脂水平(TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB)。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，组间均数比较采用t检验，计量资料以表示，基因频率比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组ApoE基因型分布 观察组E2/E2型1例(1.7%)、E2/E3型9 例(15.0%)、E2/E4 型 1 例(1.7%)、E3/E3型37例(61.6%)、E3/E4 型 10 例(16.6%)、E4/E4 型2 例(3.4%)，对照组分别为 1例(2.1%)、6 例(12.5%)、2 例(4.2%)、33 例(68.7%)、4 例(8.3%)、2 例(4.2%)，观察组 E3/E3型基因频率明显高于对照组(P＜0.05);E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型为观察组基因频率较高的基因型。

2.2 观察组ApoE不同基因型血脂水平比较 见表1。

表1 观察组E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型血脂水平比较()

表1 观察组E2/E3型、E3/E3型、E3/E4型血脂水平比较()

注:与 E2/E3型比较，*P ＜0.05;与E3/E3型比较，△P ＜0.05

观察项目 E2/E3型 E3/E3型 E3/E4型TC(mmol/L) 6.20 ±0.46 6.26 ±0.75 6.73 ±0.37＊△TG(mmol/L) 2.35 ±1.61 2.50 ±0.97 2.89 ±0.81＊△HDL-C(mmol/L)1.35 ±0.30 1.17 ±0.10*1.20 ±0.10*LDL-C(mmol/L) 3.30 ±0.60 3.62 ±0.85*4.05 ±0.75＊△ApoA1(g/L) 1.45 ±0.42 1.42 ±0.17 1.49 ±0.24 ApoB(g/L)0.73 ±0.25 0.80 ±0.30 0.80 ±0.24

3 讨论

在ApoE4/4表型中，第112位和158位均为精氨酸，其密码子为 CGC，为 HhaⅠ酶切位点(GCGC)，扩增产物经HhaⅠ酶切后可产生72 bp、48 bp、35 bp和19 bp四个片段;ApoE2/2中，这两个位置均为半胱氨酸，其密码子为TGC，不构成HhaⅠ酶切位点，酶切后只有91 bp和83 bp两个条带;ApoE3/3则在112位为半胱氨酸，158位为精氨酸，仅含有一个HhaⅠ酶切位点，酶切后产生91 bp、48 bp和35 bp;以此类推，其他三个杂合子ApoE2/3、ApoE2/4、ApoE3/4得到相应的电泳条带，因此ApoE的基因型可根据HhaⅠ酶切扩增产物后的电泳图谱进行鉴定。ApoE是血浆脂蛋白的重要组成成分，研究表明，ApoE基因多态性影响个体的血脂水平［1，2］。在正常体重人群中，不同 ApoE 基因型TC、HDL-C水平无明显差异，而超重或肥胖人群中，不同ApoE基因型TC、HDL-C水平明显不同［3］。另有研究表明，ApoE基因型与冠状动脉性心脏病和原发性高血压的发病率有相关性［4～6］。ApoE基因多态性可能通过影响脂代谢进而影响这些疾病的发生和预后。

本研究观察组E3/E3型基因频率高于对照组;观察组E3/E3型及E3/E4型HDL-C水平明显低于E2/E3型，LDL-C明显高于E2/E3型;E3/E4型TC、TG、LDL-C水平明显高于E3/E3型。提示，ApoE基因型中E3/E3型的肥胖者可能更易患高脂血症。

总之，ApoE基因多态性与肥胖伴高脂血症发病具有相关性，ApoE基因型中E3/E3型的肥胖者可能更易患高脂血症。

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