王 建，何志巍

(广东医学院中美肿瘤研究所，广东 东莞 523808)

靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚基，其在大部分恶性肿瘤组织细胞中均有较高活性，与癌症的发生、发展密切相关。我们前期研究显示，在HeLa细胞中抑制hTERT表达可下调凋亡抑制基因白血病-2(Bcl-2)的表达，并能诱导细胞凋亡［1，2］。近期，我们进行了 siRNA-hTERT 序列与pcDNA3.1-Bcl-2表达载体的共转染，旨在探讨诱导HeLa细胞凋亡的效应是否与Bcl-2有关。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌HeLa细胞(北京中科院肿瘤研究所);siRNA-hTERT序列(上海吉凯基因化学技术有限公司);pcDNA3.1-Bcl-2真核表达载体(大连宝生物工程有限公司);转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司);兔抗人hTERT多克隆抗体、兔抗人Bcl-2多克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司);碱性磷酸酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(北京中杉试剂公司);其余均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、分组及转染 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下细胞培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。将常规培养的HeLa细胞分为6个组，A组不处理，B组转染试剂，C组转染空载体，D组转染阴性siRNA，E组转染 siRNA-hTERT，F组同时转染pcDNA3.1-Bcl-2和 siRNA-hTERT。转染前调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于6孔板，每孔2 ml，达50%～60%汇合时转染。转染过程按照试剂盒说明书操作:DNA转染用量为4.0 μg/孔，转染试剂10 μl/孔;RNA 转染用量为 100 pmol/孔，转染试剂5.0 μl/孔。铺板培养基为2 ml，稀释培养基为2×250 μl。

1.2.2 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。转染后48 h，将各组细胞消化，收获，调整待测细胞浓度为5×105～1×106/ml;取1 ml细胞，1000×g，4 ℃离心10 min，弃去上清。加入1 ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮;1000×g，4℃离心10 min，弃去上清，重复两次;将细胞重悬于200 μl预冷结合缓冲液;加入10 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)避光室温反应15 min;上机前5 min加入5 μl碘化吡啶。用FACS流式细胞仪进行检测。

1.2.3 细胞hTERT、Bcl-2表达检测 采用Western blot法。转染后48 h裂解细胞提取各组细胞蛋白。用酚试剂法进行定量后，将含有等量蛋白的细胞裂解液用5×上样缓冲液稀释，置于SDS-PAGE(分离胶8%、浓缩胶5%)电泳分离，用半干转方法转移至硝酸纤维素膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h;分别加入各种一抗(1∶1000)，4℃过夜;加碱性磷酸酶标记的二抗(1∶500)，37℃孵育1 h后，用碱性磷酸酶显色液显色后扫描成像。以hTERT/β-actin相对灰度值代表hTERT相对表达水平，以Bcl-2/β-actin代表Bcl-2相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，计量数据用表示，采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

各组细胞凋亡率及hTERT、Bcl-2水平比较见表1。

表1 各组细胞凋亡率及hTERT、Bcl-2水平比较(n=5，)

表1 各组细胞凋亡率及hTERT、Bcl-2水平比较(n=5，)

注:与 A、B、C、D 组比较，*P ＜0.01;与 A、B、C、D 组比较，△P ＜0.05;与 E 组比较，#P ＜0.01

A组6.54 ±0.56 0.3316 ±0.01150.2763 ±0.0111 B 组 6.92 ±0.75 0.3260 ±0.01560.2578 ±0.0116 C 组 6.81 ±0.83 0.3267 ±0.00960.2666 ±0.0149 D 组 6.73 ±0.89 0.3304 ±0.01010.2501 ±0.0124 E 组 23.06 ±3.36* 0.0826 ±0.0068*0.0688 ±0.0057*F 组 10.98 ±2.28△#0.0734 ±0.0075*0.3016 ±0.0172#

3 讨论

细胞凋亡经典途径之一的线粒体途径由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl-2家族成员与另外的Bcl-2家族成员(Bax亚家族成员Bax、Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜表面或存在于胞质)作用，导致后者的寡聚并插入线粒体，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放Cyt-c和其他促凋亡因子，进而启动Caspase级联反应，完成相应底物的剪切，引起细胞凋亡［3，4］。Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2可与促凋亡蛋白形成二聚体，保护线粒体外膜的完整性，使促凋亡和抗凋亡作用相互中和，如果促凋亡蛋白占优势，则导致促凋亡因子从线粒体调控性的释放，从而促进凋亡，反之则抗凋亡［5］。可见，Bcl-2的蛋白水平变化与细胞凋亡过程联系密切。

更多的研究表明，在多种肿瘤组织中，hTERT的表达与Bcl-2的表达水平呈正相关［6，7］。我们的前期研究显示，在HeLa细胞中靶向hTERT的RNA干扰可以下调Bcl-2的蛋白水平，而且能诱导HeLa细胞凋亡。为了证明这种诱导凋亡作用是否与Bcl-2的蛋白水平下调有关，本研究将siRNA-hTERT序列与pcDNA3.1-Bcl-2表达载体共转染HeLa细胞进行验证。Western结果显示，4个对照组之间的hTERT和Bcl-2的蛋白表达水平没有明显差异，说明转染过程及非特异因素对蛋白表达影响可忽略不计。E组的hTERT和Bcl-2的蛋白表达水平与对照组相比显著下调，说明实现了靶向hTERT的RNA干扰进而下调Bcl-2的蛋白表达水平。F组的Bcl-2水平与E组相比显著性增高，说明pcDNA3.1-Bcl-2载体的转染逆转了RNAi-hTERT引起的Bcl-2表达下调。可见本研究的蛋白干预实验是成功的。流式细胞术分析结果显示，4个对照组之间的细胞凋亡率没有明显差异，说明转染过程及非特异因素对细胞凋亡没有显著影响。E组的细胞凋亡率与4个对照组比较显著升高，说明hTERT的蛋白表达下调可促进HeLa细胞凋亡，这与我们的前期研究结果相一致。F组的细胞凋亡率与E组比较是显著降低的，说明Bcl-2水平的下调确实在RNAi-hTERT诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥作用。而F组与4个对照组相比，凋亡率是显著升高的，说明Bcl-2不是惟一在这一过程中发挥作用的凋亡相关因子。

总之，本研究进一步明确了 Bcl-2在 RNAihTERT诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥重要作用，但不是全部作用。而其表达变化受hTERT调节的分子机制以及在这一凋亡过程中还有哪些其他因子发挥作用，还需深入研究。

［1］王建，任常山.hTERT基因沉默对HeLa细胞癌症相关基因转录的影响［J］.山东医药，2008，48(9):84-85.

［2］Wang J，Ren CS.Mechanism of induction of apoptosis by siRNA targeting hTERT in HeLa cells［J］.Chin J Cancer Res，2008，20(2):115-120.

［3］Eskes R，Desagher S，Antonsson B，et al.Bid induces the oligomerlzation and insertion of Bax into the outermitechondrial membrane［J］.Mol Cell Bid，2000，20(3):929-935.

［4］Miramas MD，Costantini P，Ravagnan L，et al.NADH oxidnse activity of mitechondrlal apoptesis-inducing factor［J］.J Binl Chem，2001，276(19):16391-16398.

［5］Jin CY，Moon DO，Choi YH，et al.Bcl-2 and caspase-3 are major regulators in Agaricus blazei-induced human leukemic U937 cell apoptosis through dephoshorylation of AKT［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(8):1432-1437.

［6］刘亮，陈建，刘凤军.结肠癌中hTERT的表达及其与Survivin和Bcl-2表达的关系［J］.中国现代普通外科进展，2010，13(3):173-176.

［7］钟英强，沈溪明，李海刚，等.hTERT在人胰腺癌组织中的表达及其与COX-2、P-gp、Bcl-2蛋白表达和临床病理特征的关系［J］.中华临床医师杂志，2008，2(8):14-18.