尹 宏，马祁生，赵海龙，黄 欣

(青海大学医学院，西宁 810001)

脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤，其发病率约占全部颅内肿瘤的40%～50%，根据肿瘤细胞的分化程度和增殖潜能等可分成4个不同的等级［1］，通常认为Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤属于低度恶性，而Ⅲ～Ⅳ级则属于高度恶性。2008年5月～2010年6月，我们检测了脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)在人脑胶质瘤组织中的表达，旨在进一步探讨两者在人脑胶质瘤发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取青海大学附属医院神经外科手术切除的脑胶质瘤组织标本48份(胶质瘤组)，患者男25例，女23例;年龄38～73岁;≤50岁28例，＞50岁20例。所有患者均经病理证实，且术前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。按WHO病理分级法分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级各12例。取正常脑组织48份(正常组)作对照。两组一般资料无统计学差异。主要试剂:兔抗BDNF和TrkB多克隆抗体(一抗，美国CHEMICON);SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);逆转录—聚合酶链反应试剂盒(TaKaRa公司);DNA2000(上海生工公司);琼脂糖(大连宝生物公司);采用Primer Premier5.0软件设计引物，引物由大连宝生物公司合成。

1.2 BDNF和TrkB蛋白检测 采用免疫组化法。标本组织常规包埋、切片。常规的SP法染色，DAB棕色呈色，阴性对照用PBS代替一抗，其余均照说明书操作。BDNF和TrkB蛋白阳性判断标准:在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野至少记数100个细胞，按每一切片阳性细胞比例及着色深浅计分，采用半定量积分法。BDNF和TrkB蛋白阳性着色主要定位于细胞质，以出现棕黄色颗粒者为阳性，阳性细胞着色判断:＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分。阳性强度:无着色或与背景均匀一致的淡黄色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据两项指标的乘积分数进行计分，0～1分为(-)，2～4分为(+)，5～7分为(++)，＞7分为(+++)。

1.3 BDNF和TrkB mRNA检测 采用RT-PCR法。取出冻存的新鲜标本(胶质瘤及胶质瘤旁正常脑组织各100 mg)，Trizol法提取组织总 RNA，测定总RNA浓度及纯度。使用Takara的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(codeD6130)反转录合成cDNA的第1链，接着合成第2链(均照说明书操作)。将所得10 μl产物冻存于-20℃以备进行PCR。PCR反应体系 50 μl，包括 5 × Buffer 10 μl，TaqDNA 酶 0.2 μl，目的引物 BDNF 及 TrkB 上下游各 1 μl，β-actin引物上下游各 1 μl，cDNA 模板 10 μl，无菌水 25.8 μl。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性45 s，退火温度55℃、60 s，72℃延伸60 s，35个循环;72℃、10 min后终止反应。PCR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶做电泳，以无菌水代替cDNA模板的PCR管为阴性对照，天能凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析。BDNF及TrkB mRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参对照β-actin电泳条带密度指数的比值来表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验;计数资料行χ2检验。RT-PCR结果和免疫组化结果的相关性采用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 BDNF和TrkB蛋白表达 胶质瘤组及正常组BDNF蛋白阳性率分别为 77.1%、41.7%，TrkB 蛋白的阳性率分别为81.2%、54.2%，两组比较P均＜0.05。

2.2 BDNF和TrkB mRNA表达 胶质瘤组及正常组BDNF mRNA的相对表达量分别为0.76±0.15、0.48 ±0.07，TrkB mRNA 的相对表达量分别为0.82±0.09、0.53 ±0.10，两组比较 P 均 ＜0.05。

2.3 BDNF和TrkB表达与胶质瘤临床病理参数的关系 见表1。

表1 BDNF和TrkB表达与胶质瘤临床病理参数的关系()

表1 BDNF和TrkB表达与胶质瘤临床病理参数的关系()

临床病理参数 n BDNF 蛋白阳性例%TrkB 蛋白阳性例%BDNF mRNA TrkB mRNA P 值性别男25 19 76 20 80 0.75 ±0.13 0.82 ±0.07 ＞0.05女23 18 78 19 83 0.78 ±0.09 0.83 ±0.08年龄(岁)≤50 28 22 79 23 82 0.77 ±0.11 0.82 ±0.07 ＞0.05＞50 20 15 75 16 80 0.76 ±0.03 0.82 ±0.05病理分级Ⅰ级 12 7 58 7 58 0.62 ±0.12 0.65 ±0.07Ⅱ级 12 8 67 10 83 0.67 ±0.03 0.69 ±0.04 ＜0.05Ⅲ级 12 10 83 10 83 0.78 ±0.10 0.81 ±0.07Ⅳ级12 12 100 12 100 0.82 ±0.14 0.89 ±0.07

2.4 相关性分析 胶质瘤组 BDNF、TrkB蛋白和BDNF、TrkB mRNA 呈正相关(r=0.805，P 均 ＜0.01)。

3 讨论

BDNF是一种在中枢神经系统内合成并广泛存在于大脑皮层、海马、基底前脑、下丘脑的最具活性的神经营养因子之一［2］。其通过TrkB参与细胞的增殖分化、黏着与成熟，进而促进中枢神经元的发育、存活、神经突起的生长和分支及损伤后的再生修复［3］。TrkB是BDNF的功能型受体，BDNF与TrkB结合，诱导TrkB受体形成二聚体，激活内在酪氨酸激酶活性使得胞内区酪氨酸残基自磷酸化;活化的受体能与多个胞内蛋白质相互作用并使其磷酸化从而将胞外信号传导至细胞内;在胞内则主要通过磷酯酰肌醇-3激酶/Akt、Ras/ERK、PLCγ等通路来发挥生物学作用［4］。BDNF能够阻止神经细胞的凋亡，其主要通过高亲和力受体TrkB发挥作用。Sugimoto等［5］在研究表达TrkB的成人神经细胞瘤的实验中观察，BDNF、NT-4可诱导成神经细胞瘤TrkB磷酸化，激活Ras/ERK信号转导通路，促进细胞增殖。以往研究表明，BDNF的表达与胶质瘤的恶性程度有关［6］。本研究胶质瘤组BDNF和TrkB蛋白、mRNA阳性表达率均高于正常组，提示BDNF和TrkB与胶质瘤有关可能参与了胶质瘤的发生。本研究还发现，BDNF和TrkB蛋白、mRNA与脑胶质瘤病理分级相关，且随恶性程度增高而增加，提示BDNF和TrkB在胶质瘤细胞内表达的高低与胶质瘤病理级别有密切关系，BDNF和TrkB的高表达在胶质瘤的发生发展过程中可能起着重要作用。

总之，BDNF和TrkB的表达可反映胶质瘤的生物学行为，可以作为判断胶质瘤恶性程度和预后的有价值的指标。

［1］Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system［J］.Acta Neuropathol，2007，114(2):97-109.

［2］Yan Q，Rosenfeld RD，Matheson CR，et al.Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system［J］.Neurosci，1997，78(2):431-448.

［3］Skup M，Dwornik A，Macias M，et al.Long-term locomotor training up-regulates TrkB(FL)receptor-like proteins，brain-derived neurot rophic factor，and neurotrophin 4 with different topographies of expression in oligodendroglia and neurons in the spinal cord［J］.Exp Neurol，2002，176(2):289-307.

［4］Almeida RD，Manads BJ，Melo CV，et al.Neuroprotection by BDNF against glutamate induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathways［J］.Cell Death Diffa，2005，12(10):1329-1343.

［5］Sugimoto T，Ikuroda H，Horii Y，et al.Signal transduction pathways through TRK-A and TRK-B receptors in human neuroblastoma cells［J］.J Cancer Res，2001，92(2):152-160.

［6］Aoyama M，Asai K，Shishikura T，et al.Human neurob lastom as with unfavorable biologies express high levels of brain-derived neurotrophic factorm RNA and a variety of its variants［J］.Cancer Lett，2001，164(1):51-60.