靳 磊，贺月林，刘 红，王 震

（湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410009）

化学农药的大量使用给环境带来了严重污染，随着人类可持续发展战略的提出，虫生真菌在害虫的持续控制及维护生物多样性方面所发挥的作用越来越受到人们的关注。目前，在农林害虫生物防治方面，真菌是研究、生产和应用最多的生物类群之一。其中，球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuillemin）是一类广谱性昆虫病原真菌，研究表明，此菌能侵染15个目149科的700多种昆虫[1-3]。在我国，球孢白僵菌广泛应用于桃小食心虫、马尾松毛虫和玉米螟等害虫的防治[4-8]。

然而，在我国白僵菌的工业化生产过程中，存在产孢量少、产孢周期长等不利因素。因此，通过菌种诱变选育来提高生产菌株的产孢量，对提高白僵菌工业化生产效率有着重要的意义。本实验选用一种效果好、设备简单、对人体无伤害的紫外诱变方法，对球孢白僵菌进行紫外诱变以获得高产菌株，再进行继代培养，最终得到产孢量大，生长速度快、致病能力强、遗传性状稳定的优良菌株，以供工业化生产所需。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 种 球孢白僵菌403001：由中国工业微生物菌种保藏中心购买，湖南省微生物所菌种保藏室保藏。

1.1.2 培养基 斜面培养基（PDA）。称取去皮马铃薯200 g。切成小块，加1000 mL水，煮沸1 h，用双层纱布滤成清液，加琼脂2%，用0.4 mol/L乳酸调pH为5.7。平板分离培养基：同上。

1.1.3 试验用虫 2～3龄越冬代马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus），取自湖南省森林植物公园。

1.2 实验方法

1.2.1 产孢量测定 以50 μL微量注射器将菌株以107个/mL的孢子悬浮液接种到铺有玻璃纸的平皿上，培养7 d。洗下玻璃纸上的全部孢子，血球计数板计数，取3次计数平均值。

1.2.2 诱变剂量的确定 取浓度为107个/mL球孢白僵菌孢子悬浮液5 mL，加入φ 90 mm的无菌培养皿中，先预热紫外灯30 min，然后开启平皿盖于磁力搅拌下分别处理 5、10、15、20、25、30 min（15 W，30 cm），然后稀释至10-6倍，分别吸取后3个稀释度的孢子悬浮液各0.2 mL涂布平板培养6～7 d，计算致死率（紫外诱变致死的孢子数与未经诱变总孢子数的比值）和正突变率（产孢量超过出发菌株403001两倍为正突变的菌落，正突变的菌株与总菌株个数的比值称正突变率），以致死率70%～80%、正突变率最高为最适剂量。

1.2.3 致病力测定 用原菌株和筛选出的突变菌株，制成107个/mL浓度的孢子液，用喉头喷雾器对2～3龄越冬代马尾松毛虫定量喷雾。每株菌5个重复，每重复10条虫，对照组喷无菌水。马尾松毛虫接种后放在玻璃瓶内，用松针饲养，纱布封口，洒水保湿，25℃下每天更换新鲜松针，同时检出死虫，将其保湿培养，观察是否白僵菌感染致死，统计死亡率。

2 结果与分析

2.1 诱变剂量的确定

球孢白僵菌403001的孢子悬浮液经紫外照射不同时间后，取样稀释，涂布于固体培养基上，每样做3皿，10 d后统计菌落数，取平均值计算诱变致死率，并用孢子计数法检测产孢能力，计算正突变率，诱变时间与致死率和正突变率之间的关系见图1。

图1 诱变时间对致死率和正突变率的影响

由图1可知，随着紫外线照射时间的延长，孢子的死亡率逐渐提高，在20 min之前正突变率随着时间的延长而提高，但继续照射，正突变率降低；在20 min时，正突变率最高，达32.2%。因此，选择20 min为最佳的诱变时间。

2.2 突变株初筛

出发菌株403001经紫外诱变20 min后，稀释并涂布到PDA培养基上培养，得到46个单菌落（表1），其中有15株正突变，31株负突变，正突变率为32.6%。

2.3 优良突变株筛选

对紫外诱变后产孢量高于出发菌株2倍以上的突变株进行继代培养，继续观察产孢量和产孢特性的稳定程度（表2）。经半年4次继代培养，403001的突变株中，仍有6株的产孢量高于出发株产孢量2倍以上，只有3株的产孢量低于出发株。

对保持较高产孢量的突变株403001-1、403001-22、403001-35和403001-38继代培养至第10代，以第一代403001菌株为空白对照，将以上4株突变株对2～3龄越冬代马尾松毛虫进行毒力测定。结果（表3）表明，突变株403001-38培养性状最为稳定，继代培养10代后，对2～3龄越冬代马尾松毛虫的致死率为72%，为出发菌株403001的2.1倍。

表1 紫外诱变后得到的单菌落产孢量变化情况

表2 继代培养后突变菌株产孢量测定

表3 正突变株继代培养后产孢量变化基毒力测定

3 讨论

紫外线诱变是一种作用时间长、效果好、设备简单、对人体无伤害的诱变方法，其诱变效应表现为：引起DNA的结构改变，阻碍DNA的复制，或引起碱基排列次序的变化，从而引起基因突变。该方法是工业生产中最常用的诱变方法之一。试验诱变获得的403001-38菌株，在平板培养基上生长快，产孢时间（5～7 d）较普通白僵菌（10～15 d）大大缩短。

经过10次继代培养，诱变株403001-38表现比较稳定，产孢量及其对2～3龄越冬代马尾松毛虫毒力一直高于出发菌株。但试验现象表明，多次继代培养后，403001-38菌株显示出菌苔变薄、表面有凹凸等现象。根据蔡国贵[9]的观点，即在扩大培养时必须选用含蛋白胨和虫尸的培养基，在保证403001-38菌株培养性状稳定的前提下，本研究下一步的工作重点为403001-38菌株抗紫外线能力、耐热性、储存活力等生物学特性测定，及其在林区应用时对马尾松毛虫的防治效果。

[1]Feng M G,Poprawski T J,Khaehatourians G G.Production,formulation and application of the entomopathgenic fungus Beauveria bassiana for insect control：currentstatus[J].Biocontrol Sci Technol,1994,4：3-34.

[2]Blake R,Bextun E,Harla n G,et a1.Field applications of baitformulated Beauveria bassiana alginate pellets for biological control ofthe red imported fire ant[J].Biol Control,2002,31（4）：746-752.

[3]Felipe T,Mario Z,Raquel A,et a1.Pathogenicity ofBeauveria bassiana[J].FloridaEntomol,2004,87（4）：533-536.

[4]李春香，张淑红.白僵菌对害虫致病性的研究进展[J].唐山师范学院学报 ，2005，27（5）：40-43.

[5]刘 健，陈洪章，李佐虎.白僵菌杀虫剂生产工艺研究状况与展望[J].中国生物防治，2003，19（2）：86-90.

[6]李春香，顾丽嫱，张淑红，等.常用农药与球孢白僵菌复配对甜菜夜蛾的毒力研究 [J].安徽农业科学，2009，37（9）：4086-4088，4123.

[7]付志坚，陈建新，付丽君.白僵菌对昆虫的致病机理研究综述[J].武夷科学，2000，16（1）：105-109.

[8]郑 军，芦冬涛，曹 勇，等.白僵菌对菜青虫的致病效果及应用研究[J].广东农业科学，2010，37（5）：104-106.

[9]蔡国贵，林庆源，徐耀昌，等.白僵菌菌株退化与培养条件关系及其控制技术[J].福建林学院学报，2001，21（1）：76-79.