李富强， 白宏英， 娄季宇， 曾志磊

缺血性脑卒中是一种高致残高死亡的脑血管疾病，及时应用药物溶栓或血管内支架疏通阻塞血管是改善患者预后的关键。然而，伴随血管再通产生的大量自由基或活性氧可以加重脑缺血损伤，即再灌注损伤。缺血再灌注损伤有效预防方法不多。尽管大量研究证实脑缺血预处理可以有效减轻缺血再灌注损伤［1］，但由于该干预措施必须在脑缺血发生前实施，而缺血性脑卒中发生的不可预料性限制了其临床应用价值。2006年Zhao等研究发现脑缺血再灌注早期给于短暂的缺血/再灌注循环可以显著减少脑梗死面积，并提出了脑缺血后处理这一概念［2］。线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition，MPT)被认为是引起细胞凋亡或坏死的关键因素［3］。脑缺血后处理的作用机制未明，可能与减少组织自由基损伤、减轻炎性因子释放、减轻脑水肿等［4］有关。脑缺血后处理能否影响线粒体通透性转换，尚未见有研究报道。因此，本实验拟观察缺血脑组织MPT在脑缺血后处理过程中的变化，进而探讨脑缺血后处理的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制作 采用Longa大鼠MCAO模型方法，略作修改。应用10%水合氯醛(3ml/Kg)腹腔注射麻醉，分离左侧颈外、颈总动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉远端;在颈外动脉残端剪一小孔，将4-0号尼龙线前端加热形成圆球形后从残端小孔插入，沿颈内动脉至大脑前动脉以阻断大脑中动脉的血流。阻闭30min后抽出尼龙线，恢复再灌注。应用激光多普勒血流仪的探头(P407，瑞典Perimed)检测脑血流。切开左侧颅顶皮肤，并清理颅骨表面筋膜，将探头放置在左侧囟门后中线外2mm处。左侧大脑中动脉脑血流下降低于70%视为造模不成功予以排除。术中体温由肛温探头监测仪监测，用150瓦灯泡烘烤维持肛温37℃。

1.2 动物分组 清洁级SD雄性大鼠(250g～300g)由郑州大学实验动物中心提供。将SD大鼠随机分成4组:(1)假手术组(sham);(2)缺血再灌注组(I/R);(3)缺血后处理组(Postcond);(4)延迟缺血后处理组(Delaypost)(每组n=20)。假手术组采用同样的操作步骤，仅暴露颈总动脉但不插入颈内动脉;缺血再灌注组:缺血30min后给予再灌注;缺血后处理组:缺血30min再灌注时，立即给予30s再灌注/30s缺血处理，反复3个循环;延迟缺血后处理组:缺血30min再灌注15min后，再给予30s再灌注/30s缺血，反复3个循环(见图1)。

图1 实验动物分组示意图

1.3 脑组织匀浆的制备 各组大鼠(n=6)于再灌注30min后断头处死，用冷生理盐水冲洗血迹后，滤纸拭干，称重，按组织比生理盐水1∶9加人冰冷的生理盐水，制成10%匀浆。所有操作均在4℃下进行。

1.4 脑线粒体的制备 各组大鼠(n=6)于再灌注30min后断头处死，立即取出大脑，去除脑干、嗅球及小脑，留取左侧大脑半球。冷生理盐水冲洗血迹后，将脑组织置于预冷的匀浆介质(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4，0.01 mol/L EGTA)的缓冲液中。用预冷的眼科剪将脑组织剪成2mm×2mm×2mm的小块后充分匀浆，制成10%的匀浆。采用差速离心法分离线粒体，应用低温高速离心机4℃以650×g离心20min后弃沉淀;取上清液以 7700×g离心 20min，将沉淀应用(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4)溶液悬浮即制成线粒体悬浮液;上述操作均在4℃下进行［5］。采用Bradford法进行线粒体蛋白浓度测定。

1.5 脑梗死面积测定 大鼠脑缺血30min再灌注24h后，断头，迅速取脑，每组各8只。鼠脑沿冠状切面切片，每片厚约2mm，脑片迅速置于2%的TTC溶液中37℃蕴育约30min，正常组织呈玫瑰红色，缺血梗死组织则为苍白色，10%福尔马林溶液固定后，用数码相机拍照后输入计算机，应用图像分析软件计算梗死面积百分比。梗死容积=(对侧正常组织容积－同侧正常组织的容积)/对侧正常组织容积×100%。

1.6 脑组织丙二醛测定 硫代巴比妥酸(TBA)法检测组织丙二醛，脂质过氧化产物丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合形成红色产物，在532nm波长处有最大吸收峰。具体方法按南京建成科技有限公司试剂盒说明书进行操作。

1.7 线粒体通透性转换孔开放测定 线粒体通透性转换孔开放引起线粒体肿胀，导致线粒体吸光度下降［6］。应用线粒体肿胀测定液(0.2 mol/L sucrose，10mmol/L Tris-Mops，pH7.4，5mmol/L succinate-Tris，1mmol/L Pi-Tris，10μmol/L EGTA-Tris，2μmol/L rotenone，1μg/ml oligomycin)将线粒体稀释浓度为 0.5mg/ml蛋白溶液。反应条件控制在25℃、pH7.4。反应开始在反应体系内加入150μmol/LCa2+作为激发剂，应用 UV-2000紫外分光仪(尤尼柯，上海)在540nm处检测线粒体吸光度的改变。

1.8 统计学方法 数据分析采用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均采用±s来表示，组间比较应用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 缺血后处理对脑梗死容积影响 缺血再灌注24h后，缺血后处理组与缺血再灌注组和延迟缺血后处理组相比脑梗死容积明显减小(P＜0.05);延迟缺血后处理组与缺血再灌注组相比脑梗死容积变化无显著性差异(P＞0.05)(见图2)。

图2 缺血后处理对脑梗死容积的影响

2.2 缺血后处理对脑组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影响 与缺血再灌注组和延迟缺血后处理组相比，缺血后处理组和假手术组脑组织丙二醛含量显著降低(P＜0.05);延迟缺血后处理组与缺血再灌注组相比，差别无统计学意义(P＞0.05)(见图3)。

图3 缺血后处理对脑组织MDA的影响

2.3 缺血后处理对通透性转换孔的影响 缺血后处理明显抑制Ca2+所诱发的540nm波长处线粒体吸光度的改变(P＜0.05)，而延迟缺血后处理组与缺血再灌注组两者差别无显著性差异(P＞0.05)(见图4);延迟缺血后处理组和缺血再灌注组线粒体吸光度改变值明显增加，但两者间差异无统计学意义。

图4 缺血后处理对线粒体通透性转换的影响

3 讨论

Zhao等首先应用大鼠大脑中动脉远端永久闭塞联合双侧颈总动脉短暂闭塞脑缺血再灌注模型，发现再灌注时立即给予3个30s缺血/再灌注循环可以明显减少脑梗死容积，减少半暗带区TUNEL阳性细胞数，减轻缺血区脑组织的氧化损伤等。其研究结果还表明，缺血后处理的保护作用与缺血严重度呈负相关，缺血越严重缺血后处理的保护作用越弱;再灌注损伤是缺血时期的重要病理过程，缺血后处理可以明显减轻缺血再灌注损伤［2］。本研究结果提示:脑缺血后处理有明显的脑保护作用;脑缺血后处理的脑保护作用有时间依赖性，再灌注时立即缺血后处理保护作用明显，延迟15min的缺血后处理未显示明确的脑保护作用。在实验中我们应用大鼠大脑中动脉缺血模型发现:再灌注期即刻给予3个30s的缺血/再灌注循环的缺血后处理能明显减小脑梗死容积，但延迟缺血后处理未能减少脑梗死容积。而且缺血后处理能明显减少脑组织中膜磷脂过氧化代谢产物MDA的含量，而延迟缺血后处理未显示类似的效应。

线粒体通透性转换是反映线粒体功能及完整性的重要指标。线粒体内膜上的通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)非特异性开放将导致膜电位的崩溃，线粒体内呼吸链的解偶联，细胞色素C及其他促凋亡因子的释放导致细胞凋亡［7］。我们研究发现，脑缺血后处理能抑制Ca2+诱导的mPTP开放，而延迟15min的缺血后处理组与缺血再灌注组mPTP开放增加，两组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，结果表明延迟缺血后处理不能减少mPTP的开放。缺血后处理调节mPTP开放机制尚不清楚。实验研究表明，活性氧促发和 Ca2+超载是影响 mPTP开放关键因素［8］。Zhao等研究发现缺血期缺血脑组织血流量下降了约50%，但再灌注早期缺血脑组织有类似充血的反应，脑血流增加到180.1% ±46.0%，而应用缺血后处理可以减弱再灌注早期的类似充血的反应［2］。在缺血期，由于无氧酵解增加，脑组织中乳酸含量明显升高，线粒体ATP酶活性降低，ATP合成减少。由于ATP合成减少，不能有效泵出Na+、Ca2+，最终引起Na+、Ca2+超载，溶酶体泄漏，导致细胞骨架与细胞膜磷脂的损害［9］。应用药物溶栓或血管介入使阻塞血管再通，可以阻断上述病理过程。但随之出现缺血再灌注损伤。再灌注早期血液中的氧与缺血组织内单电子物质相互作用，产生大量的活性氧，诱导mPTP开放破坏线粒体膜，加速线粒体膜肿胀破坏，释放细胞色素C及其他促凋亡因子，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族诱导细胞凋亡或坏死［7］。我们推测缺血后处理可能通过减少再灌注时期活性氧的生成，增加线粒体对Ca2+超载的抵抗能力而起作用。缺血后处理可能通过减弱再灌注早期的类似充血的反应，减少活性氧的生成，减轻了线粒体膜的损伤，维持线粒体内外离子平衡。我们研究发现缺血后处理可以降低MDA的生成间接验证了缺血后处理减少活性氧物质生成。延迟缺血后处理可能因不能有效减弱再灌注早期的类似充血的反应，故不能减少活性氧的促发，而不能起到脑保护作用。Argaud等在New Zealand兔心肌缺血再灌注模型研究中发现，心肌缺血后处理可以增加线粒体对Ca2+超载的抵抗能力、延迟Ca2+诱导的mPTP开放而起到心肌保护作用［10］。此类保护机制是否存在于脑缺血再灌注损伤模型中，有待于进一步证实。

当然我们的研究也有一定的局限性:首先我们仅仅观察了24h内的脑保护作用，是否有更长久的脑保护作用尚未知。其次，我们选择30s缺血/再灌注循环源自Zhao等的研究报告，是否是最佳干预时间尚未知，需进一步研究证实。再次，我们选择延迟15min实施延迟缺血后处理，是基于在一些研究模型中发现再灌注早期活性氧生成在4～7min达峰值。延迟多久不会对缺血后处理脑保护作用产生干扰，还需进一步研究。

脑缺血后处理作为一种新奇的、简单的脑保护措施，给临床治疗提供了一种新的治疗策略。脑缺血后处理可能应用在药物溶栓或血管内介入血管再通的治疗过程中。但其安全性、有效性需要大量基础与临床研究去证实。总之，我们研究发现脑缺血后处理可能通过抑制mPTP开放起到脑保护作用，其保护作用有时间依赖性。脑缺血后处理可能会成为治疗缺血性脑卒中新的方法之一。

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