黄波，王晓东，郎贤平

（辽宁医学院附属第一医院胸外科，辽宁 锦州 121000）

小细胞肺癌是恶性度极高的肿瘤，早期即发生淋巴及血行转移是其重要的临床特点。小细胞肺癌的转移是多基因参与的复杂过程［1］。研究资料表明，ABCE1蛋白能够阻断干扰素介导的2-5A/核糖核酸酶L细胞抗病毒通路，并诱导前列腺癌的发生与转移，参与结肠癌的原始免疫应答［2］，但ABCE1基因与肺癌及其转移的相关报道较为罕见。因此我们构建了含有新霉素Neo基因（可用G418筛选）且带有绿色荧光的ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表达载体，并将其转染入小细胞肺癌细胞，筛选出稳定转染ABCE1-siRNA的小细胞肺癌细胞株，为进一步研究ABCE1基因在小细胞肺癌中的作用打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人小细胞肺癌细胞株NCI-H446由中国科学院细胞库引进。新生小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI-1640培养基和FUGENE HD购于美国Gibco公司。菌株E.coliDH5α购于上海闪晶生物公司。pRNAT-U6.1/Neo购于上海闪晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA载体构建：将合成的引物退火，95℃10 min后自然冷却。将pRNA-U6.1/Neo载体用BamHI/HindⅢ双酶切。使用DNA Ligation Kit将退火产物与pRNAT-U6.1/Neo载体4℃过夜连接。热转化至E.coliDH5α中，分别命 名 为 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N，涂布平板后，37℃培养过夜。从转化平板上挑取白色阳性单菌落，提取质粒并测序。

1.2.2 G418浓度的确定：将对数生长期的NCIH446细胞用胰酶消化，以3×105个/孔接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。铺板第 2 日加入不同浓度的 G418（50、100、200、300、400、500 μg/ml），每 3 d 换液 1 次，换液同时加入G418，共培养3周。

1.2.3 细胞转染及阳性克隆的筛选：转染前1 d，NCI-H446细胞用胰酶消化，接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，当细胞达到70%～80%融合时，准备转染。转染当天更换为无胎牛血清的RPMI-1640培养基，每个培养孔1 000 μl。取 FUGENE HD 10 μl，按照转染试剂∶DNA（μg）为10∶2的比例加入构建成功的载体DNA，混匀后室温孵育30 min，加入到6孔板中培养，6 h后加入100 μl胎牛血清。转染48 h后，荧光显微镜下观察转染情况。转染成功后，加入 G418（400 μg/ml）的培养液进行筛选，24 h后将转染并进行筛选的细胞按1∶10的比例传代，每3～5 d换液1次。继续培养约1周待单克隆长到相对较大的集落后，于荧光显微镜下挑取细胞集落至24孔板。于24孔板继续培养，并继续用 G418（200 μg/ml）的培养液进行筛选，约 3～5 d换液1次，待细胞长满后，将仍有荧光的细胞转入6孔板培养。6孔板长满后转入培养瓶培养，取部分作Western blot之用，根据Western blot结果确定筛选效果。

1.2.4 Western blot鉴定阳性克隆：收取部分细胞，加入预冷裂解缓冲液，剪碎，超声匀浆，低温超速离心。吸取上清液，Lowry法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶90 V电泳3 h后转印。洗膜后1%BSA封闭非特异性抗原2 h。缓冲液洗膜，与一抗（1∶250）4℃孵育过夜。洗膜后与碱性磷酸酶标记二抗（1∶200）室温下孵育2h。NBT/BCIP显色，以NC膜上出现清晰的棕褐色条带为阳性，终止显色，漂洗并干燥后避光保存。

2 结果

2.1 ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA载体的构建及连接

ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2，ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N，涂布平板后，37℃过夜培养。从转化平板上挑取单菌落，测序并电泳，可见构建的质粒约6 500 bp大小（图1），选取阳性克隆的PCR产物进行测序，测序结果与设计的序列一致（图2）。

图1 构建后ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA质粒电泳Fig.1 Identification of recombinant plasmid ABCE1-siRNA

图2 构建后ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA质粒测序结果Fig.2 Sequencing analysis of recombinant plasmids and of the synthesized siRNA oligonucleotides

2.2 G418浓度的确定

将对数生长期的NCI-H446细胞用胰酶消化，接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液。加入不同浓度的 G418（50、100、200、300、400、500 μg/ml），培养约 6 d 后可见各组均有细胞死亡，培养12 d后可见400、500 μg/ml G418组细胞均死亡，而其他组虽也有细胞死亡但未完全死亡，因此确定G418筛选浓度为400 μg/ml。

2.3 细胞转染及阳性克隆的筛选

应用FUGENE-HD转染48 h后可见ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N 转染效率可达50%以上。因构建的ABCE1-siRNA含有绿色荧光蛋白，转染后荧光显微镜观察细胞胞质内可见绿色的荧光（图3），转染质粒后NCI-H446细胞略肿胀，部分细胞变圆、死亡。经 G418（400 μg/ml）筛选2周后，大多数细胞死亡，仅少数细胞存活，并形成克隆（图4）。将形成克隆的细胞挑至24孔板，继续培养并用半量G418（200 μg/ml）筛选，培养约3周后，细胞形成较密集的克隆。将细胞消化传代至6孔板，继续培养并用半量 G418（200 μg/ml）筛选，培养约2周后单个细胞均形成小克隆时，转入培养瓶中继续培养，约3周后细胞长满培养瓶（图5）。收集细胞，部分细胞行Western blot鉴定。在筛选过程中发现转染ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2后，细胞在筛选过程中增殖明显减慢，证实干扰ABCE1基因后NCI-H446细胞增殖减慢。

图3 转染ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA 48 h的NCI-H446细胞×100Fig.3 NCI-H446 cells transfected with ABCE1-siRNA for 48hours×100

图4 经G418筛选2周后形成克隆的NCI-H446细胞 ×100Fig.4 Clonal NCI-H446 cells after screening two weeks by G418×100

图5 扩大培养的稳定转染NCI-H446细胞 ×100Fig.5 Stable transfection NCI-H446 cells after expanding culture×100

2.4 ABCE1-siRNA对ABCE1蛋白表达的影响

Western blot检测ABCE1蛋白表达水平，可见68 kDa处有1条特异条带。凝胶成像系统灰度扫描ABCE1现色条带，转染ABCE1-pRNAT-U6.1/NeosiRNA后，将筛选克隆并扩大培养的细胞与未转染的细胞相比，ABCE1蛋白表达量明显下降（图6）。表明ABCE1-siRNA能够抑制小细胞肺癌细胞ABCE1基因表达，同时表明ABCE1-siRNA稳定转染入NCI-H446细胞株，并筛选出了沉默ABCE1基因的稳定转染细胞株。

图6 Western blot结果Fig.6 Western blot of ABCE1

3 讨论

小细胞肺癌的发生是一个多因素、多阶段的过程。尽管放疗、化疗、生物治疗以及手术治疗在治疗小细胞肺癌方面取得了一定的进展，但小细胞肺癌的复发和转移仍然是一个巨大的难题［3］。目前己经初步认识到小细胞肺癌的发生、发展、侵袭和转移是人体细胞基因组结构和功能异常所致。

ABCE1基因定位于常染色体4q31上，属于ATP结合盒多基因家族成员之一。它在真核细胞胞质内编码一种名为核糖核酸酶L（ribonuclease L，RNase L）抑制因子的68 kDa蛋白，能够阻断干扰素介导的2-5A/核糖核酸酶L细胞抗病毒通路，抑制细胞凋亡过程，并可在促进蛋白质合成及细胞增殖分化方面发挥作用［4］。RNA干扰是指在生物细胞内，外源性或内源性的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引起与其同源mRNA的特异性降解，从而抑制其相应基因表达的过程［5］。由于这种技术具有效率高、特异性强、显效快、可以向子代遗传和同时进行多基因研究等优点，使其很快成为了基因研究的热点。本研究构建了ABCE1基因的siRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2、ABCE1-pRNAT-U6.1/NeosiRNA-N。该载体含有Neomycin抗性基因作为筛选标签，用于稳定转染。同时该载体于起始端含有CMV启动子，在CMV下方携带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）报告基因，可用于观察转染效率。将ABCE1-siRNA转染入小细胞肺癌细胞NCI-H446，经过G418筛选近3个月，获得稳定转染ABCE1的siRNA细胞株，经Western blot鉴定达到持续沉默ABCE1的效果。

为了获得稳定转染的细胞株，细胞的转染效率是十分关键的因素。转染率太低不易筛选稳定克隆，一般要求转染效率要高于30%。影响转染效率的主要因素有：（1）细胞状态：健康的细胞培养物是成功转染的基础；（2）血清：无血清转染时的转染率明显高于血清存在情况下的转染率，因此在转染前要去除血清；（3）DNA质量：DNA 要高纯度、无菌，最好是无内毒素的；（4）转染试剂和DNA的比例及培养时间：在本研究中按照FUGENE-HD说明书进行预实验时，我们应用了不同的脂质体与核苷酸的比例，包括 5∶2，6∶2，7∶2，8∶2，9∶2，10∶2，12∶2。实验结果证实，针对NCI-H446细胞进行FUGENE-HD转染的可靠条件为：转染时间为48 h时达到最大转染率，脂质体与核苷酸的用量比例为10∶2。本实验通过以上细节的调整，转染效率可达50%以上。为进一步获得稳定转染的细胞克隆，我们应用了G418进行筛选，筛选约2周左右可见单克隆形成。应用200μl加样枪挑取有荧光的单克隆后，继续应用G418（200μg/ml）筛选约2个月后，我们获得了稳定转染细胞株。该稳定转染细胞株的成功筛选为进一步研究ABCE1基因对小细胞肺癌的作用打下了实验基础。

［1］Baines AT，Lim KH，Shields JM，et al.Use of retrovirus expression of interfering RNA to determine the contribution of activated K-Ras and ras effector expression to human tumor cell growth［J］.Methods Enzymol，2006，407（6）：556-574.

［2］Shea PR，Ishwad CS，Bunker CH，et al.RNASEL and RNASEL-inhibitor variation and prostate cancer risk in Afro-Caribbeans［J］.Prostate，2008，68（4）：354-359.

［3］Yano S，Zhang H，Hanibuchi M，et al.Combined therapy with a new bisphosphonate，minodronate（YM529）and chemotherap for multiple organ metastases of small cell lung cancer cells in severe combined immunodeficient mice ［J］.Clin Cancer Res，2003，9 （14）：5380-5385.

［4］Lingappa JR，Dooher JE，Newman MA，et al.Basic residues in the nucleocapsid domain of Gag are required for interaction of HIV-1 gag with ABCE1（HP68），a cellular protein important for HIV-1 capsid assembly［J］.J Biol Chem，2006，281（7）：3773-3784.

［5］Rodriguez-Lebron E，Paulson HL.Allele-specific RNA interference for neurological disease［J］.Gene Ther，2006，13（6）：576-581.