张秀军,高润平,张瑞娟,朱 杰

(吉林大学第一医院肝病内科,吉林长春 130021）

肝纤维化是以各种慢性致病因素作用于肝脏大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM）在肝内合成和沉积为特征。在肝纤维化的发生和发展过程中,肝脏慢性炎症反应导致肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC）激活,转化为具有表达а-平滑肌动蛋白(а-SMA）、增殖活性的肌成纤维样细胞,激活的HSC是肝脏ECM产生的主要细胞[1]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）是一种具有分泌特性的细胞基质蛋白,其与TGF-β1共同诱导肝纤维化的发生。CTGF是TGF-β1诱导大鼠HSC、胰星状细胞、成骨细胞合成I型胶原的下游介导者[2-4]。近来Gressner等[5]报道慢性丙型肝炎和酒精型肝炎患者血清CTGF的升高可直接反应其肝纤维化的进展情况。本研究通过检测慢性乙型肝病患者血清CTGF的水平,探讨血清CTGF水平与肝组织CTGF表达及肝纤维化程度的相关性,以评价血清CTGF水平在慢性乙型肝病(CLD-B）患者肝纤维化诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2008年10月至2009年6月在吉林大学第一医院肝胆胰内科门诊和住院CLD-B患者(血清HBsAg均为阳性）共155例,其中CHB 89例,男56例,女33例,平均年龄43.5±24.6岁;活动性肝硬化35例,男23例,女12例,平均年龄42.7±19.3岁;静止性肝硬化31例,男21例,女10例,平均年龄45.2±20.8岁。肝硬化患者按Child-Puph分级,肝储备功能A级46例,B级20例。对照组30例为健康者,从我院体检中心募集,其中男18例,女12例,平均年龄33.3±13.6岁。

1.2 样品采集与处理空腹采集所有患者及健康对照者静脉血4 mL,留取血清冻存于-80℃冰箱备用。对其中31例肝脏活体穿刺标本经常规甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色及Van Gieson氏胶原染色,进行肝组织炎症分级和纤维化分期。

1.2.1 血清CTGF检测 ELISA法检测人血清CTGF,试剂盒购自美国ADL。操作流程按说明书进行,使用Bio-Rad 550酶标仪(USA）在波长450 nm测得OD值,根据样品OD值及标准曲线计算待测样品的浓度。

1.2.2 肝组织CTGF mRNA检测 采用多项寡核苷酸探针和高敏感标记技术检测人肝组织CTGF mRNA,试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。操作步骤参见试剂盒说明书。采用AEC显色,胞浆出现红色颗粒为阳性细胞,苏木素复染,水性封胶封片。采用计算机图像分析系统Image-Pro Plus 6.0,对每张切片随机取10个400×视野,扫描CTGF mRNA阳性细胞,计算其平均积分光密度值(integrated optical density,IOD）。

1.2.3 免疫组化染色检测肝组织α-SMA UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司,鼠抗人α-SMA单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。肝组织α-SMA检测按试剂盒说明书进行。DAB显色,苏木素复染。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。

1.2.4 统计学处理

统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行,血清CTGF水平用±s表示,两样本均数比较用t检验;Spearman法进行相关性分析。P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 CTGF mRNA在肝组织的表达

CHB肝小叶内窦周间隙可见α-SMA表达阳性的激活HSC(图1A）,激活的HSC是表达CTGF mRNA的主要细胞(图1B）。CTGF mRNA阳性的细胞在LC纤维化条带内部及周边被检出(图1C）,与胶原纤维分布一致(图1D）。

2.2 血清CTGF的测定结果

慢性乙型肝炎、活动性肝硬化患者血清CTGF水平明显高于正常对照组(P＜0.01）,静止性肝硬化患者血清CTGF水平亦高于正常对照组(P＜0.05）。活动性肝硬化和慢性乙型肝炎患者血清CTGF水平之间比较差异无显著性(表1）。

图1 CHB组织病理学

表1 CLD-B患者及健康对照者血清CTGF测定结果(±s）

表1 CLD-B患者及健康对照者血清CTGF测定结果(±s）

注:与对照组比较,*P＜0.01,△P＜0.05

组别 n CTGF(μ g/L）对照组 30 2.21±0.42慢性乙型肝炎 89 9.15±3.35*活动性肝硬化 35 9.73±3.60*静止性肝硬化 31 5.42±2.56△

2.3 CTGF与肝纤维化分期及炎症分级的关系

CLD-B患者肝纤维化程度越重肝组织CTGF mRNA表达越强,血清CTGF水平越高,Spearman相关分析显示CLD-B患者血清CTGF水平与肝组织CTGF mRNA表达及纤维化的程度呈正相关关系(r=724,r=0.549,均为P＜0.05）。(表2）

CLD-B患者血清CTGF水平与肝组织炎症程度无相关性(P＜0.05）。

表2 CLD患者血清和肝组织CTGF水平与肝纤维化分期的关系(±s）

表2 CLD患者血清和肝组织CTGF水平与肝纤维化分期的关系(±s）

纤维化分期 n CTGF(μ g/L） CTGF mRNA(IOD）S0 4 2.35±0.46 8.18±4.23 S1 4 4.27±1.63 19.54±9.46 S2 8 5.74±1.67 24.71±12.13 S3 7 7.26±1.83 32.36±15.35≥S4 8 8.56±1.78 38.76±18.41

3 讨论

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV）感染是肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的主要原因[6]。Martín-Vílchez S等通过体外细胞联合培养的研究证实:肝细胞通过表达和分泌HBV X蛋白(HBx）刺激人HSC激活和增殖,使 CTGF和 I型胶原合成增加[7]。近来,Liu Xuan等采用HepG2.2.15培养上清刺激人肝星状细胞株(LX-2）,结果显示:HBV可短暂感染LX-2细胞,并直接刺激LX-2增殖,使I型胶原的合成明显增加[8],这些研究为HBV致肝纤维化提供了直接的实验依据。我们先前的研究表明:靶向CTGF的锤头核酶通过阻断内源性CTGF的合成,有效抑制基础和TGF-β1诱导的人HSC合成I型胶原和细胞向S期转化[9],说明CTGF在HSC介导肝纤维化发生学起着重要的作用。本研究发现CHB患者肝组织窦周间隙激活的HSC表达CTGF mRNA,CTGF mRNA阳性的细胞可在LC纤维化条带内部及周边检出,且与胶原纤维分布具有良好的一致性,这就从组织病理学进一步说明CTGF在HSC介导慢性HBV感染所致肝纤维化发生学的作用。

在过去的5-10年中,其他来源的纤维原性细胞亦在肝纤维化病灶中检出,包括骨髓源性纤维细胞、门管区纤维原细胞及由肝细胞和胆管细胞通过上皮间质转化形成的肌成纤维样细胞[10-12],这些细胞在不同原因所致肝纤维化发生学发挥相应的作用,并受制于相应疾病进程[13]。既往普遍认为定居于肝小叶窦周间隙的HSC在慢性乙、丙型肝炎患者肝纤维化发生学起着重用的作用,本研究发现CHB门管区炎症部位有CTGF mRNA表达阳性的纤维原细胞,其有可能参与CTGF介导的慢性HBV感染所致肝纤维化的发生学。

CTGF是一种分泌型基质蛋白,其与TGF-β1共同承担肝纤维化发生的功能。本研究表明:CLD-B患者血清CTGF水平与肝纤维化程度呈正相关,进一步提示血清CTGF可作为CLD-B患者反映进展性肝纤维化的一种血清标志。

目前,在世界范围内普遍将肝活检组织病理学作为诊断肝纤维化的“金标准”[15]。然而肝活检存在创伤性,取样误差,加上病理观察者的变异等缺点,而影响肝纤维化诊断的准确性。近年来通过检测血清HA、LN、C IV,来评价在肝纤维化诊断方面的价值,但特异性和敏感性并不理想。本研究通过检测CLD-B患者血清和肝组织CTGF水平,评价其与肝组织纤维化分期及炎症分级的关系,结果表明:血清CTGF的升高水平与肝组织CTGF mRNA表达强度及肝纤维化程度呈正相关关系,而与肝组织炎症程度无关。因此认为,检测血清CTGF对诊断CLD-B患者肝纤维化具有实际临床意义。

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