姜倩倩，曹 慧

（潍坊学院，山东 潍坊 261061）

流式细胞术在高等植物细胞学研究中的应用＊

姜倩倩，曹 慧

（潍坊学院，山东 潍坊 261061）

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析技术，目前已广泛应用于细胞生物学、发育生物学、细胞动力学、分子生物学等植物学研究的多个领域。本文简要论述了流式细胞仪的工作原理，并对其在高等植物细胞学研究中的应用做了综述。

流式细胞术；细胞核；染色体；细胞凋亡

流式细胞仪（Flow Cytometer）是一项集激光技术、光电测量技术、计算机技术、电子物理、流体力学、细胞免疫荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它的研制、发展、革新和应用领域的扩展是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的［1］。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对生物颗粒（细胞、细胞器、微生物）的多种物理和生物学特性进行定量分析，并可根据测量的参数，同时将测量群体中的一个或两个亚群加以分选的细胞分析测量技术，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。

FCM在医学临床方面的应用较为广泛，如肿瘤学、免疫学、血液学及临床检验等，并拓展到生物学的各个领域，如细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学，分子免役学，生物化学等。FCM在植物中尤其是高等植物中的应用较晚，直到20世纪80年代中期才开始，主要是适合流式细胞分析的植物单细胞悬液制备比较困难。FCM要求所提供的样本必须是完整的细胞或细胞核的悬浮液，由于植物细胞不同于动物细胞，除了具有细胞壁外，植物细胞中还含有大量次生代谢物，这就给制备样本增加了难度，大大降低了流式实验的成功率。自从Dolezel等［2］发现利用植物根尖分裂组织或者幼嫩叶片较易获得合适的单细胞悬液后，FCM在植物学研究方面得到了广泛应用，其中细胞核DNA分析、倍性分析、染色体结构分析、细胞周期分析等方面是其应用最广泛的领域。

1 流式细胞仪的工作原理

待测细胞被制备成单个细胞悬液，经特异性荧光染料标记后，在气体压力下，以一定速度进入流动室。流动室内充满了同轴方向流动的鞘液，样品在鞘液的约束下，细胞呈单个排列形成液柱以均等的时间依次通过流动室的喷嘴，然后从喷嘴喷出进入检测区。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光，分别由聚光系统中的不同滤光片收集并送到检测器上。用于FCM的检测器主要有硅光电二极管和光电倍增管。硅光电二极管适合于强光的检测，常用于前向角散射光（FSC）的测量。光电倍增管适合于弱光的检测，常用于荧光及侧向角散射光（SSC）的检测。检测器将进入的光信号转变为电信号后，经模拟数字（A／V）转换器转换为数据，经计算机分析后，细胞的一系列重要物理化学特性就被快速、大量地测定出来［3－4］。

此外，流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取，它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体，可以产生高频振荡，产生同频机械振动，流动室也随之振动，因此液流断裂为均匀的液滴，其形成速度与振动频率有关，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过电场，在电场的作用下发生偏转，然后落入相应的收集器之中，从而实现细胞分选。

2 流式细胞仪在植物细胞学研究中的应用

2.1 识别和分拣植物染色体

1984年，De Laat和Blass［5］第一次报道了流式细胞技术识别和分拣植物染色体。他们制备了模式植物纤细单冠菊的完整染色体悬浮液，通过流式细胞术分离了2种染色体类型。随后，流式细胞技术被广泛应用于植物染色体研究中，目前已对数十种植物种类进行了染色体分析，其中豆类及禾谷类作物应用最多。

识别和分拣染色体的流式细胞仪是专门带有分拣设备的流式细胞仪，也叫荧光激活流式细胞分拣仪，分析的样品是染色体悬浮液，分离和分选的对象是中期染色体或染色体的部分，是亚细胞水平的技术操作。其原理是有丝分裂中期细胞去细胞壁后制成特异性荧光染色的染色体悬浮液，作为样品加入到流式细胞仪并形成狭窄的液流按一定顺序高速通过光学检测系统的高强度光束，已染色的染色体产生的荧光被量化，进而根据染色体大小、形态和相对荧光强度对染色体进行分类分析。通过把高速液流截断成液滴，带电荷的含有所需染色体的液滴经过静电场会偏离液流，从而分离和纯化单个染色体［6］。传统的荧光染色方法是用1－2种DNA荧光染料对染色体悬浮液进行染色，相对的荧光强度分布分别以单参数和双参数流式核型显示［7］。理想的话，每个染色体应以较分散的峰面被区别出来。但实际分拣时，由于许多种植物的染色体大小差异较小，只能在其流式核型分析图中形成一个复合峰，若仅通过流式分拣，尚不能达到分拣单条染色体的水平。此外，由于植物染色体悬浮液浓度低，染色体筛选的速度受到严重影响。因此，制备好的染色体悬浮液是应用流式分析的关键。

被FCM分选出来的植物染色体可被筛选到尼龙滤纸、显微镜玻片、PCR试管或其他试管。单条染色体分拣能将基因组化整为零，克服了基因组过大难以分析的困难，提高特定染色体片段和特定基因分离和研究的效率；另外在克隆之前，通过分割基因组可以大大减少文库筛选；分拣的染色体的形态可以得到良好的保持，具有广泛的应用范围和广阔的发展前景。其中，就可应用FCM分选出活的原生质体，并通过分选出来的原生质体再生出植株，其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。刘继红等［8］采用流式细胞术，对酸橙（Citrus aurantium L）叶肉原生质体和甜橙（C sineniscv Shamouti）胚性愈伤组织原生质体电融合后再生的体细胞杂种进行分析，发现所有的体细胞杂种植株荧光强度是二倍体对照的两倍，这说明两者的原生质体已经融合。可以分选出来用于新品种的培育。

2.2 测定植物细胞核DNA含量

1983年，Galbraith运用流式细胞术成功测定了17种植物的核DNA含量，为运用流式细胞术检测植物核DNA含量的研究开创了先河。DNA与其荧光染料如PI（碘化丙啶）、EB（溴化乙啶）、HO33342、HO33258、DAPI（4’6－二脒基二苯基吲哚）和AO（吖啶橙）等定量结合后，经激光照射发出特异荧光。在同一条件下，经荧光试剂处理的细胞核内DNA分子数目越多，这些DNA促发荧光的强度也就越强，直接反映细胞核DNA含量的高低。

理论上，在细胞分裂时，随着染色体数目的成倍增加，细胞核DNA含量成倍增加，检测到的荧光强度也必然成倍增加。细胞核DNA相对含量的高低与细胞的倍性密切相关，根据细胞核DNA含量的高低可进行倍性鉴定。倍性鉴定的方法一直是多倍体研究的重要内容之一，染色体计数法虽然准确性高，但操作复杂，用于大量材料的倍性鉴定仍相当困难，而利用细胞学特征进行倍性鉴定虽然易于进行，但鉴定的准确性有待于提高。近年来，FCM开始用于植物细胞核DNA含量的研究，目前已对柑橘［9］、葡萄［10］、大白菜［11］及菊花［12］等进行过研究。这些研究表明，利用FCM测定细胞核DNA的相对含量是一条快速方便，且准确性高的鉴定植物染色体倍性的途径。

用流式细胞仪进行倍性分析时，常用DNA的绝对含量或相对含量来进行分析。如果要测量DNA的绝对含量，就必须设一个标准的样品，来换算出DNA的绝对含量。通常用已知细胞核DNA含量的鸡血红细胞核作测量标准。付改兰和冯玉龙［13］利用流式细胞仪鉴定多种杂草倍性时，就是以已知细胞核DNA含量的鸡血红细胞核作测量标准。测定DNA的相对含量时，选择一个已知倍性的同类材料作对照，所有待检测的样品均与其作比较，即可换算出待检样品的DNA相对含量，并对其进行倍性分析。2005年日本Kulthinee等［14］用已知DNA含量的大麦品种做对照，使用流式细胞仪鉴定多种猕猴桃品种的倍性。

2.3 分析植物细胞周期

应用FCM计算测量植物细胞核内DNA含量以及鉴定染色体倍性实际上是细胞周期的测量。流式细胞仪对单个细胞内DNA含量进行分析时，通过标记物发出荧光的强弱可推算出G0、G1期（二倍体）、S期（超二倍体）、G2、M期（四倍体）的比例，其结果以DNA分布的直方图的形式显示，进而可由G0／G1，S／G2＋M比率来了解细胞的增殖能力，并可了解细胞的增殖状态。［15］

2.4 检测植物凋亡细胞

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡，是由基因控制的细胞自主性的有序的死亡过程，是生物体生长发育过程中出现的正常现象，在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持细胞内环境稳定等过程中发挥重要作用。FCM检测凋亡细胞的方法包括三个方面。

2.4.1 形态学检测

在FCM检测时，前向散射光（FSC）的强度与细胞大小有关，而侧向散射光（SSC）的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时，细胞膜皱缩，胞浆浓缩，体积变小，细胞内颗粒往往增多，所以凋亡细胞的典型特征是前向角散射下降和侧向角散射升高。［16］

2.4.2 细胞DNA含量的检测

在凋亡细胞内，由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成，核内的总DNA含量下降，利用FCM检测细胞的DNA含量可以形成直方图，如果在直方图上二倍体细胞峰的左方出现亚二倍体峰，即凋亡峰就说明存在细胞凋亡，并且通过测定凋亡峰的高度可以确定凋亡细胞的比例。［17］

2.4.3 DNA断裂点标记法

细胞凋亡的最后阶段是形成DNA片段，DNA断裂点法检测的即是DNA的断裂片段，即标记DNA断裂的3′－羟基末端，常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口转移（in situ nick translation，ISNT）或用Td T介导的d UTP原位缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end labeling，TUNEL）技术，两者均可进行间接或直接标记。间接标记物常为生物素化脱氧三磷酸尿苷（biotin－d UTP）或地高辛配体（Dig）－d UTP等，此外还需要连霉亲和素或抗Dig－d UTP，使标记反应增倍，提高灵敏度；直接标记的标记物常为异硫氰酸荧光素（FITC）－d UTP。［18－19］

3 结束语

近年来，FCM作为一种日渐成熟的技术，已经深入到植物研究的诸多领域，给工农业生产和科学研究提供了一个强有力的工具。目前，利用FCM不但可以对植物细胞进行计数、测量基因组大小，还能分析细胞周期、鉴定核型（染色体的DNA含量）、分拣染色体以及构建染色体文库等。FCM作为一种生物检测技术已经日臻完善，仪器的硬件平台也已达到稳定的技术状态。但是，这种技术还有一些自身的缺点，如价格昂贵、对操作人员要求高以及样品需要复杂的前处理等，这都限制了流式细胞术在植物领域中的应用。科学家和仪器制造商又纷纷将研究的焦点转向荧光染料的开发、单克隆抗体技术、细胞的制备方法以及提高电子信号的处理能力上来，以拓展FCM日趋广泛的应用领域。我们相信流式细胞术作为一种不断完善的技术在植物学研究中将有更加广阔的应用前景。

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（责任编辑：肖恩忠）

Applications of Flow Cytometry in the Study of Higher Plant Cytology

JIANG Qian－qian，CAO Hui
（Weifang University，Weifang 261061，China）

In this paper，the foundational characteristics of the flow cytometry were briefly described，and its applications in the study of higher plant cytology，including cell nuclei，protoplast，chromosome，and cell apoptosis were elaborated.

flow cytometry，cell nuclei，chromosome，cell apoptosis

2011－07－24

姜倩倩（1983－），女，山东泰安人，潍坊学院生物工程学院讲师，博士。研究方向：果树生理与分子生物学。

S601 文献标识码：A 文章编号：1671－4288（2011）06－0082－04