白立景,鞠辉明,牟玉莲,杨述林,李 奎,陈明勇

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 海淀 100193)

植酸酶(phytases)是广泛存在于动植物及多种微生物中的一种磷酸酶,可以催化植酸(肌醇六磷酸)和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或磷酸盐)。自然界中,豆类等油料作物及谷物中的植酸是磷的主要存储形式,由于一些单胃动物缺少植酸酶而不能利用这些形式的磷,所以只能通过在饲料中添加无机磷来满足正常生长及代谢需要,而动物体内的植酸磷不能利用而通过粪便排出体外,造成磷资源的浪费和环境的磷污染。通过在畜禽饲料中添加植酸酶促进植酸磷的利用是国内外普遍采用的手段[1]。生产中应用的植酸酶大多通过工程菌产生,按照目前的技术体系,很难在短时间内通过工程菌的方法大幅度提高表达效率,因此利用真核表达系统,通过哺乳动物的生物反应器制备植酸酶是一个高效低成本的方法[2]。本试验应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶ap p A2基因,构建了app A2基因真核表达质粒pcDNA-ap p A2,并在猪 PK15细胞进行了初步表达,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pcDNA3.1(+)质粒、DH5α大肠杆菌感受态细胞、埃希大肠杆菌菌株、PK15细胞系,由本院保存。Liperfectamine 2000购自Invitrogen生物公司;胎牛血清和DMEM培养基购自GIBCOL BRL公司;限制性内切酶 HindⅢ、EcoRⅠ购自Fermantas公司;Ex-Tag E及定量PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司;T 4 DNA连接酶购自Promega公司;植酸钠购于Sigma公司。

1.2 pcDNA-app A2真……