任保彦，付成福，宫鹏涛，韩乾忠，杨 举，李 赫，张国才，张西臣，李建华

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062)

斯氏艾美尔球虫(Eimeria stiedae)是多种兔球虫中危害最为严重的一种，呈世界性分布，对幼兔的危害尤为严重，感染率和死亡率高。目前对E.stiedae主要是以药物进行防治，但由于球虫极易产生耐药性而导致球虫病源很难清除，而目前国内外所用兔球虫疫苗的免疫效果均不理想[1-2]。因此，寻找新的可靠的疫苗将是最为有效的手段。E.stiedae的肌动蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor，ADF)是ADF家族的一员，ADF家族蛋白通过切断肌动蛋白纤丝和增加肌动蛋白纤丝解聚作用来重塑细胞骨架，进而影响如细胞增殖、迁移、凋亡及胚胎发育等重要的生理功能[3]。肌动蛋白和ADF在顶复门寄生虫运动、粘附和侵入宿主过程中起到关键作用，也是疫苗候选基因研究的重点。本研究构建重组pVAX-1-ADF真核表达质粒，并转染HeLa细胞检测其表达水平，为E.stiedae新的候选疫苗分子的筛选奠定基础。

1 材料和方法

1.1 虫株、菌株、质粒和细胞株E.stiedae、HeLa细胞由本实验室保存；E.coliTOP10购自TaKaRa公司；真核表达载体pVAX-1、载体pMD18-T购自Invitrogen公司。

1.2 主要试剂 TRIzol购自Invitrogen公司；DNA和蛋白质标准分子量Marker购自天根生化科技有限公司；DNA质粒小量提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司；FuGENERHD Transfection Reagent购自瑞士Roche公司。

1.3 ADF基因的克隆 根据柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)的ADF基因设计引物，并在其两端分别引入酶切位点EcoRⅠ、HindⅢ；……