李晶梅，张 萍，秦红刚，魏 筱，廖园园，漆世华，温文生，刘汉平

(武汉中博生物股份有限公司，湖北武汉430070)

支原体(Mycoplasma)是一类无细胞壁的原核微生物，能够通过细菌滤器，并能够在无细胞的人工培养基中生长繁殖。《中华人民共和国兽药典》规定所有活疫苗必须保证无支原体污染。目前，对支原体的检测方法较多，包括分离培养法、PCR法、DNA荧光染色法、电镜法、免疫结合试验、生化检测法、直接血凝试验、探针法等[1-4]。以上方法各有特点，需根据具体目的，选择检测方法。培养法是以支原体培养基作为基础，应用支原体培养技术来检验样品中有无支原体污染，是生物制品支原体检测普遍采用的方法。DNA荧光染色法又称为指示细胞法，是将检测样品接种于指示细胞中培养，以特异性荧光染料染色，通过在荧光显微镜下观测附着在细胞表面的支原体DNA着色来判定支原体的污染。PCR方法是通用引物对支原体核酸进行扩增的一种检测方法。本研究主要采用病毒分离培养法、DNA荧光染色法和PCR法对PRRSV冻干疫苗中支原体污染进行检测。

1 材料和方法

1.1 细胞株和检测样品 Vero细胞由本研究室保存；Marc-145细胞、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PRRSV半成品抗原液、PRRSV冻干疫苗成品均由武汉中博生物股份有限公司提供。

1.2 主要试剂 DNA荧光染料Hoechst 33258和蛋白酶K均购自Sigma公司；支原体检测试剂盒购自Bioind公司。

1.3 检测样品的准备 将Marc-145细胞复苏传代培养，备用；取0.5 mL PRRSV种毒，病毒含量≥107TCID50/mL，接种Vero细胞培养3 d～5 d，备用；将10批PRRSV半成品抗原液，每批15瓶～25瓶不等，每瓶分别取样0.5 mL，接种Vero细胞培养3 d～5 d，备用；……