于 莲，赵向男，崔 丹，杜 妍（佳木斯大学药学院黑龙江省高校生物药制剂重点实验室，佳木斯市 154007）

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命。依托泊苷（Etoposide，ET）为鬼臼毒素的糖代谢产物，具有广谱抗癌活性，尤其对早期扩散、预后恶劣的小细胞肺癌效果良好。改变剂型、提高已有抗癌药的疗效、降低其毒副作用，已成当务之急。固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）的研究起始于20世纪90年代，是新型的亚微给药系统，其不但可以促进药物吸收、减少药物毒性，而且还有控释、靶向的功能[1]。本试验将ET制成SLN，以期通过缓释作用提高药物的疗效。

1 仪器与试药

JY92-2D型超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JB-2型恒温磁力搅拌器（上海雷磁仪器厂）；Zetasizer 3000 HS纳米粒度及表面电位分析仪（英国Malvern公司）；JEM-1200Ex透射电镜（日本电子公司）；1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LE-80K型超高速冷冻离心机（美国Beckman公司）。

ET原料药及对照品（淄博磐信医药化工有限公司，批号：PX20091105，含量：99.4%）；ET-SLN（佳木斯大学药学院自制，批号：20100315，含量：12.4%）；单硬脂酸甘油酯（天津市博迪化工有限公司）；大豆磷脂（上海金伴药业有限公司）；泊洛沙姆（型号：188，德国BASF公司）。

2 方法与结果

2.1 ET-SLN制备

采用乳化-超声分散法制备。称取处方量单硬脂酸甘油酯（脂质材料）与ET混匀，加热70℃熔融，作为油相。将大豆磷脂、泊洛沙姆作为复配乳化剂加入10 mL重蒸馏水溶解，迅速加热至相同温度作为水相。在磁力搅拌下将油相滴加到同温度水相中制备成初乳[2]，继续搅拌同时加入冷水（4℃）至20 mL。超声波细胞破碎机600 W超声10 min，冷却至室温，得ET-SLN分散液，用0.45µm微孔滤膜过滤得ET-SLN胶体分散液，同法制备不含药物的SLN分散液，作为空白对照。

2.2 正交试验筛选ET-SLN最优处方

通过前期单因素考察结果得知，脂质材料和乳化剂的用量对ET-SLN的包封率有较大的影响。分别以单硬脂酸甘油酯、大豆磷脂、泊洛沙姆、ET的处方用量为A、B、C、D 4个因素，每个因素设3个水平，采用L9（34）正交设计表，以包封率（EE/%，包封率＝（c总投药量－c上清液）/c总投药量×100%）为评价指标进行正交试验，结果见表1、表2、表3。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

Rj的值越大，说明该因素影响越明显；由此可知，各因素影响的主次顺序是B＞A＞D＞C，由表2得出的最优化处方为第8号处方，即A3B2C1D3，单硬脂酸甘油酯、大豆磷脂、泊洛沙姆、ET的处方用量分别为0.020、0.010、0.015、0.015 mg，该处方制得ET-SLN包封率较高，选取最优处方按“2.1”项下方法制备3批，计算包封率结果见表4。

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Variance analysis

表4 3批ET-SLN包封率测定结果Tab 4 Encapsulate coefficiency of 3 batches of ET-SLN

2.3 ET-SLN形态、粒径、表面电位的测定

纳米粒体系用水稀释20倍，吸取2滴，用2%磷钨酸钠负染，以透射电镜观察其形态及分布，结果见图1；以激光粒度分析仪测定粒径和粒度分布，结果见图2。

图1 ET-SLN透射电镜图（×105）Fig 1 TEM of ET-SLN（×105）

图2 ET-SLN粒径分布Fig 2 Distribution of particle size of ET-SLN

由图1可见，制得的ET-SLN形态较圆整，大小较均一，基本为类球形的实体粒子。ET-SLN平均粒径（83±0.5）nm、粒度分布窄。

以表面电位分析仪测定Zeta电位，结果为（－23±0.3）mV，属热力学稳定体系[3]。本研究制得的纳米粒表面带有负电荷，可以与带正电荷的药物作用，从而得到高包封率的载药纳米粒。

2.4 包封率和载药量的测定

2.4.1 含量测定

（1）色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-乙腈＝30∶50 ∶20；检测波长为285 nm；流速为0.7 mL·min－1；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

（2）溶液制备及系统适用性试验：对照品溶液：精密量取ET对照品贮备液（500 μg·mL－1）1 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释，定容，制得50 μg·mL－1的对照品溶液进样。供试品溶液和空白溶液：精密量取ET-SLN或空白SLN 0.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容；精密量取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加流动相定容即得。进样后，3种溶液色谱结果见图3。

图3 高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms

（3）线性范围及方法学考察：精密称取ET对照品适量，用流动相溶解并稀释成浓度为50 μg·mL－1溶液。分别精密量取上述溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，流动相定容后进样。以峰面积（A）对浓度（c，mg·mL－1）作图，绘制标准曲线，得回归方程A＝41.368c+383.06（r＝0.999 3），ET检测浓度线性范围为0.01～0.035 mg·mL－1；平均回收率为98.8%（RSD为0.77%，n＝9）；精密度试验中RSD为0.67%（n＝6）。

2.4.2 包封率和载药量测定方法

采用低温超速离心法。精密移取纳米粒1 mL，然后超速离心（30 000 r·min－1）30 min，上清液稀释后用高效液相色谱法测定，计算药物包封率和载药量（载药量＝（c总投药量－c上清液）/c纳米粒×100%）。结果，3批ET-SLN包封率平均为81.2%，平均载药量为12.4%。

2.5 体外释放试验

采用动态透析袋法考察体外释放情况，根据《中国药典》2010年版二部附录释放度测定法[4]进行。ET在37℃时，其在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中饱和溶解度仅为145～150 mg·L－1。移取2 mL的ET-SLN分散液置于截留分子量为14 000的透析袋中，两端夹紧，置于装有PBS 50 mL的锥形瓶中，在（37±0.5）℃恒温水浴振荡器中，分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h将介质全部取出（同时补加50 mL空白释放介质），过0.22 μm微孔滤膜，测定药物含量，计算累积释药率，绘制体外释药曲线，详见图4。

图4 ET-SLN体外释药曲线Fig 4 Drug release profile of ET-SLN

由图4可知，ET-SLN在最初的2 h，释放了药物总量的40%左右；随后，结合在脂质纳米粒骨架中的药物呈相对缓慢的速度释放，可持续48 h。

3 讨论

采用乳化-超声分散法制备ET-SLN操作简单、易于控制，仪器价格低廉、成本低，比较适合实验室操作。

以生理相容的、可生物降解的单硬脂酸甘油酯作为脂质材料制备的SLN的粒径较小且分布均匀；以大豆磷脂和泊洛沙姆（188）作复合乳化剂时，可以提高SLN表面的亲水性、增大空间位阻及调整电位，延长SLN在体内的循环时间，不但能够有效地降低粒径，而且制得的纳米粒稳定性较好。

体外释药时，在2 h内，药物分子可能一部分吸附在纳米粒的表面，或者富集在纳米粒的外层而产生突释，此后药物的释放主要是从固体骨架中扩散，并达到缓释作用。

[1] 翟 文，陈庆华，朱宝泉.固体脂质纳米粒的研究进展[J].中国医药工业杂志，2001，32（9）：424.

[2] 耿叶慧，杨 丽，张 瑜，等.吡喹酮固体脂质纳米粒的制备及其理化性质研究[J].中国药房，2007，18（28）：2 197.

[3] 曹露晔，闫晶超，王玉生，等.蓝萼甲素固体脂质纳米粒的制备及理化性质研究[J].中国药房，2008，19（9）：666.

[4] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩD.