怀牛膝药材的HPLC指纹图谱研究Δ

2011-08-06赵变常珍珍史彪孙祥德新乡医学院药学院新乡市453003

中国药房 2011年39期

赵变，常珍珍，史彪，孙祥德（新乡医学院药学院，新乡市453003）

四大怀药包括牛膝、地黄、山药、菊花，是著名的河南道地药材，产于焦作。其中，牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，味苦、甘，性平，归肝、肾经。能补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行，用于治疗腰膝酸痛、筋骨无力、肝阳眩晕[1]等证。2010年版《中国药典》（一部）中将牛膝类药材分为牛膝和川牛膝2种收录。现代中药化学和药理学研究表明，牛膝中含有皂苷类[2]、植物甾酮类[3]、糖类[4]、黄酮类等化学成分。人们对牛膝的药理、毒理及其化学成分等方面的研究逐渐深入，但尚缺少综合评价药材品质的方法和标准。目前，通过建立指纹图谱来控制中药的质量已成为越来越多人的共识[5]，但有关怀牛膝的指纹图谱研究少见报道，仅有的文献方法[6]存在组分峰相对较小、分离度不高、未经相似度评价等不足。因此，本试验采用高效液相色谱（HPLC）法建立了怀牛膝原药材和经硫磺熏制过的怀牛膝药材的指纹图谱，并进行了相似度比较，以期为该药材的全面质量控制提供依据。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-6AD型HPLC仪、SPD-20A型紫外检测器（日本岛津公司）；FA2004型分析天平（上海良品仪器有限公司）；超声波清洗器（工作频率：59 kHz，功率：45 W，上海科导超声仪器有限公司）。

甲醇（色谱纯，天津赛孚瑞科技有限公司）；冰醋酸（分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司）；5-羟甲基糠醛标准品（批号：A0298，纯度＞99%）、蜕皮甾酮标准品（批号：A0217，纯度＞99%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；试验所用原药材和熏制药材均购自河南道地产区GAP示范基地，并经新乡医学院药学院中药学教研室荆云副教授鉴定为真品（药材来源见表1），将药材粉碎，过二号筛，置广口瓶中密塞备用[硫磺熏制方法：将药农初加工后牛膝放入缸内，反复冲水洗净泥土，放入牛膝焙中，点燃硫磺锅，用草苔覆盖，按每100 kg牛膝用硫磺2 kg熏制8 h；然后用大锅将水温成100℃，把牛膝带茎端（茎下3 cm）用水冲洗1 min后闷放2 h，再冲清水，放入牛膝焙中，按每100 kg牛膝用硫磺1 kg熏蒸6 h]。

表1 药材来源Tab 1 The origin of medicinal samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min：A∶B＝0∶100；45 min：A∶B＝45∶55；55～65 min：A∶B＝70∶30）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：279 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 标准品溶液的制备

取蜕皮甾酮标准品10 mg，精密称定，以甲醇溶解并稀释制成每1 mL中含1.0 mg的蜕皮甾酮标准品贮备液，备用。取5-羟甲基糠醛标准品11 mg，精密称定，以甲醇溶解并稀释制成每1 mL中含1.0 mg的5-羟甲基糠醛标准品贮备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取怀牛膝样品粉末（过四号筛）2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称重，超声提取1 h，冷却后补足重量，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 对照试验分别精密吸取标准品溶液和供试品溶液各20 μL，注入HPLC仪，记录80 min内的色谱峰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 精密度试验取一新制备的供试品溶液适量，在上述色谱条件下连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对峰面积和相对保留时间基本一致。对测定结果以相似度软件进行计算，可得相似度分别为0.990、0.992、0.994、0.985、0.991，均＞0.98，RSD＝0.34%（n＝5），表明本方法精密度较好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.3 稳定性试验取一新制备的供试品溶液适量，在上述色谱条件下分别于0、2、4、6、12、24、48 h进样，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对峰面积和相对保留时间基本一致。对测定结果以相似度软件进行计算，可得相似度分别为0.989、0.991、0.994、0.990、0.986、0.992、0.994，均＞0.98，RSD＝0.29%（n＝7），表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4.4 重复性试验取同一批药材适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰相对峰面积和相对保留时间基本一致。对测定结果以相似度软件进行计算，可得相似度分别为 0.974、0.984、0.999、0.997、0.998、0.985，RSD＝1.02%（n＝6），表明本方法重复性较好。

2.5 怀牛膝药材指纹图谱的建立[7]

2.5.1 怀牛膝原药材指纹图谱的建立取12批怀牛膝原药材供试品溶液各20 μL分别进样，所得HPLC图谱以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件，得到12批怀牛膝原药材的HPLC指纹图谱叠加图，详见图2A。

2.5.2 经硫磺熏制过的怀牛膝药材指纹图谱的建立按“2.5.1”项下方法处理11批经硫磺熏制过的怀牛膝样品，得到经硫磺熏制过的怀牛膝药材的HPLC指纹图谱叠加图，详见图2B。

图2 HPLC指纹图谱叠加图Fig 2 HPLC fingerprints

2.5.3 相似度分析运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件将各药材的指纹图谱进行数据处理，生成指纹图谱的共有模式即为对照图谱，计算各样品图谱与对照图谱的相似度。12批怀牛膝药材与11批经硫磺熏制过的怀牛膝药材的相似度见表2。以蜕皮甾酮峰为内参比峰，计算各共有峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3～表6。

表2 12批怀牛膝药材和11批经硫磺熏制过的怀牛膝药材的相似度Tab 2 Similarities of 12 batches ofA.bientata and 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

表3 12批怀牛膝原药材样品指纹图谱共有峰相对保留时间Tab 3 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

3 讨论

本试验建立了怀牛膝药材的HPLC指纹图谱，并首次建立了经硫磺熏制过的怀牛膝的指纹图谱，为怀牛膝药材的质量控制提供了新的依据。原药材中标定了24个共有峰，通过标准品对照指认了2个色谱峰，其中9号峰为5-羟甲基糠醛，18号峰为蜕皮甾酮（见图1C）。

运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件进行分析，结果表明，12批原药材中，9批药材的相似度均在0.9以上，证明怀牛膝药材的相似度较高，其所含化学成分有较高的相似性；第5、9、10批样品的相似度在0.9以下，这可能是由于土壤环境（如砂土、炉土、混合土等不同土质）以及不同农户施肥情况不同，导致其部分成分的含量有差异。

表4 12批怀牛膝原药材样品指纹图谱共有峰相对峰面积Tab 4 Relative peak areas of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

为了便于保存，且使其色泽好看，药商常将收购的中药饮片或原药材进行硫磺熏制处理。用硫磺熏制过的中药或多或少地含有硫磺化合物，这不仅不卫生，还可能对人体有毒害[8]。试验表明，怀牛膝原药材和经硫磺熏制过的药材有很大差异：在相同的试验条件下，经硫磺熏制过的样品不仅整体出峰较高，而且在前30 min内组分色谱峰数目明显增多，说明怀牛膝药材经硫磺熏制以后不仅化学成分的量发生了改变，而且在硫磺的作用下原有组分发生了化学作用，产生了新的物质。如，原药材图谱中8～13号之间的峰对应硫磺熏制药材中7～11号之间的峰，可见硫磺熏制药材的峰明显增高。相似度结果也表明，11批经硫磺熏制过的怀牛膝药材的整体相似度下降，其中有4批相似度在0.8以下，说明药材经硫磺熏制后其组分的种类和量的变化程度不一，难以控制。11批硫磺熏制药材中标定了20个共有峰，其中被指认出的5-羟甲基糠醛峰在硫磺熏制后增加尤其明显。5-羟甲基糠醛会对人的横纹肌造成一定的伤害，《中国药典》对部分中药材中5-羟甲基糠醛有含量限度规定，所以在对怀牛膝进行质量标准的完善时亦应增加对5-羟甲基糠醛含量的限量标准，以确保药材的质量符合临床用药要求。

表5 11批经硫磺熏制过的样品指纹图谱共有峰相对保留时间Tab 5 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

试验比较了回流、索氏、超声3种样品提取方法，结果表明，3种方法的提取效果接近，因此选用操作更为简便、省时的超声提取法。再对不同提取时间（30、60、120 min）、不同醇浓度（50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、95%乙醇、50%乙醇、正丁醇）进行了比较，最终确定以50%甲醇超声60 min作为供试品溶液的制备方法，所得色谱峰峰数多、峰面积大、整体基线好。