侯广玉，刘长军，张艳萍，杨玉英，张 锋，丛 锋，杨文闯，许娜娜

(1.中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319；3.牡丹江医学院基础部，黑龙江牡丹江157011)

马立克氏病(Marek's Disease，MD)是由MD病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤性疾病。该病对养禽业危害严重，主要应用疫苗免疫来防控。自20世纪70年代开始，不同血清型的疫苗毒株被用于防制该病，MD得到很好的控制。然而随着MDV毒力不断增强，现有疫苗对鸡群保护能力降低，研制新一代疫苗是非常必要的。MDV野毒株在体外系列传代致弱是获得新疫苗株的一种可行的方法[1-3]。为了获得对中国流行的MDV株免疫效果更好的疫苗，本研究对4株国内MDV流行强毒株进行了细胞培养连续传代的弱化培育，并分析了高代次病毒株对SPF鸡的致病性、增殖特性和基因变异等生物学特性，为进一步筛选MDV致弱疫苗株提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、SPF鸡及鸡胚 实验中所用MDV L-SY、L-MS、L-CZ和L-ZY株由本实验室分离鉴定及保存[4]。1日龄SPF白来航鸡、9日龄～10日龄SPF鸡胚均由本研究所实验动物中心提供。

1.2 主要实验材料 E.coliDH5α感受态细胞由本实验室制备保存；细胞培养用Medium199和犊牛血清均购自美国GIBCO公司；pMD18-T载体、ExTaq DNA聚合酶、HSTaq酶、150 bp DNA Marker、DL2000 DNA Marker和DL15000 DNA Marker购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及DNA提取试剂盒均购自北京华舜生物试剂公司。

1.3 病毒体外传代致弱 按常规方法采用9日龄～10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞(CEF)。4株强毒株分别接种于CEF，于37℃ 5%CO2条件下培养，48 h～72 h出现典型细胞病变(CPE)，当病变率达到70%左右时用0.25%胰酶消化成单细胞，适量接种到新鲜的CEF中。……