钱年超，贾立军，薛书江，张 影，张守发

(延边大学农学院/动物医学系，吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)是由泰勒虫科(Theileriidae)、泰勒虫属(Theileria)的瑟氏泰勒虫寄生于红细胞和淋巴细胞内引起的一种血液原虫[1-2]。该病以高热、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状。由于近几年来经贸活动的频繁和养牛业的规模化，该病的流行区逐渐扩大，特别是该病对外地引进牛、纯种牛和改良杂种牛的危害大，已成为严重影响养牛业的疾病之一[3-4]。T.sergenti的抗原成分复杂，其中主要表面蛋白(P33和P32)具有较好的免疫原性，在抗T.sergenti感染中具有重要作用[5]。近年来，国内外学者对此研究较深，但是，一直以来，研制的疫苗未能给动物机体带来稳定、有效的免疫。基于T.sergenti疫苗的研究现状，本实验根据文献[6]证实的表位(E1：DTSKFTPTVA HRLKHAEDLF；E2：APDAFGTGKVYDFVGNFKVT KVKFE)，结合表位分析软件，筛选出主要表面蛋白的2个优势抗原表位并串联成双表位融合基因，进行了原核表达，为构建安全有效的多表位T.sergenti疫苗提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料 牛血液和血清样本采自吉林省延边州某牧场；DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、ExTaq酶、T4连接酶、pMD18-T载体、pGEX-4T-2载体、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ等均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α和BL21由预防兽医学实验室保存。

1.2 引物的设计与合成 根据T.sergentiMPSP(Major piroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)，应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计了2对引物，P1、P2为表位E1的引物，P3、P4为表位E2的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为P1：5'-CGGGATCCGCCAATGA GGGATACCGT-3'； P2： 5'-ACCAGAACCTCCACCT CCAGATCCACCTCCACCCCATTCCTTGTCGCTCTT C-3'； P3： 5'-GGATCTGGAGGTGGAGGTTCTGGTG GTGGAGGATCTGGTCTTTTTGCCCCTG-3'； P4：5'-CCGCTCGAGCTTTGACTGCGGTGTATTT-3'。

下划线为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点；方框内为linker(Gly4Ser)3的核苷酸序列。

1.3 目的片段的扩增 以DNA提取试剂盒提取的T.sergenti基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，扩增E1表位基因；……