王俊杰 刘 彬 韩 一 苏 明 郑 斌 (河北医科大学基础生物化学教研室，河北 石家庄 050017)

基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)中一种重要的锌离子水解酶，能够降解作为动脉粥样斑块基底膜和纤维帽重要组成部分的Ⅳ型胶原，促进中膜平滑肌细胞向内膜下迁移〔1，2〕，加速动脉粥样硬化进程，并导致不稳定性斑块的形成〔3，4〕。研究发现MMP-2基因启动子区域-1306位点存在C/T置换现象〔5〕，可能引起其组织表达水平不同，从而影响动脉粥样硬化的病程，这种碱基序列的不同提示人群中存在遗传性冠心病事件的易感性。本研究采用病例对照方法，拟探讨MMP-2启动子区单核苷酸多态性(SNPs)与冠心病发病风险及冠脉病变程度的关系，进一步阐明冠心病的发病机制。

1 对象与方法

1.1 对象 均来自河北地区无血缘关系人群。冠心病组:共89例，男70例，女19例，年龄42～71〔平均(58.1±9.7)〕岁，来自河北医科大学第二医院、河北省人民医院、沧州市人民医院，均符合WHO冠心病诊断标准;同时行冠状动脉造影，以左冠状动脉主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉至少有1支狭窄≥50%为阳性，累及左主干时以同时累及左前降支和左回旋支计算。非冠心病患者(对照组):共97例，男48例，女49例，年龄25～60〔平均(42.4±14.3)〕岁，均为健康体检者。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与制备 冠心病组在冠状动脉造影前采集空腹血标本，对照组在清晨空腹采静脉血。标本置于含有0.2 ml的2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，－70℃保存，待提取基因组DNA。

1.2.2 模板DNA的提取 依照北京博大泰克生物公司聚合酶链式反应(PCR)试剂盒操作步骤进行。

1.2.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，dNTP(10 mmol/L);引物均由上海生工生物工程公司提供，上游为5'actgactctggaaagtcagagca 3'，下游为 5'ctgagacctgaagagctaaagaggt 3'。PCR 反应体系为 60 μl，其中包括:去离子水33.3 μl，10 × 缓冲液 6 μl，MgCl2(25 mmol/L)6 μl，dNTP 1.2 μl，上、下游引物混合物(10 μmol/L)6 μl，Taq DNA 聚合酶 1.5 μl，模板 DNA 6 μl。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃复性45 s，72℃延伸 45 s，30 个循环;最后 72℃延伸10 min。

1.2.4 1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物 取PCR扩增产物5 μl，按5∶1(V/V)与6×上样缓冲液混合后，上样于1% 琼脂糖凝胶板负极端(含0.05 μg/ml EB)，1×乙酸电泳缓冲液(TAE)中120 V电压电泳20 min，电泳完毕后紫外灯下观察。与DNA Marker比对，可观察到长度为408 bp的扩增片段。

1.2.5 测序 将电泳正确的PCR产物送交上海生工生物工程公司进行测序，比对测序结果，见图1。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件。运用哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)遗传平衡定律检验样本的群体代表性。两组人群中基因型及等位基因频率分布的比较采用计数资料的χ2检验进行分析。

图1 PCR产物测序

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 冠心病组与对照组经检验均为遗传平衡群体，表明研究对象的选择无群体遗传学偏差。见表1。

表1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.2 EMP-2基因型和等位基因频率在两组中的分布情况 冠心病组与对照组相比，基因型频率与等位基因频率的差异均无统计学意义，提示MMP-2基因启动子区-1306位点C/T多态性与冠心病无相关性。见表2。

表2 MMP-2基因型的分布及等位基因频率〔n(%)〕

2.3 MMP-2基因型对冠状动脉病变程度的影响 见表3。冠心病患者基因型分布与冠脉狭窄累及支数无关(P＞0.05)。

表3 MMP-2基因型对冠状动脉病变的影响(n)

3 讨论

冠心病中冠状动脉粥样斑块的形成和发展过程与细胞外基质(ECM)重构的过程有密切联系。其中，MMP-2的作用十分重要。研究表明血清MMP-2水平与急性冠脉综合征、冠状动脉病变程度具有相关性〔6〕，动物实验发现MMP-2基因缺失可抑制平滑肌细胞从中膜到内膜的迁移及内膜增生〔7〕，Jenkins等〔8〕发现在球囊损伤后鼠颈动脉内膜细胞中MMP-2的激活与血管平滑肌细胞的迁移一起进行，在接受PTCA的患者中也存在相似的情况。由于MMP-2启动子区-1306C/T的变异会影响其表达水平，与动脉粥样硬化的发生和发展有关〔9〕，因此本研究选择此位点观察其与冠心病的遗传易感性及冠状动脉病变程度的关系。

本研究发现，MMP-2启动子区-1306位点CC/CT基因型与冠心病的遗传易感性不存在相关性，与冠状动脉病变程度亦无关系，可能此位点突变与否不影响该蛋白的表达水平。考虑在冠心病的发生过程中，多种遗传与环境因素相互作用最终对疾病的发生起决定作用。在以后的研究中，对各种影响因素应综合考虑，从而对冠心病的预防起到指导性的效果。

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