白利民 申 强 (吉林省人民医院，吉林 长春 130021)

条件复制型腺病毒又称肿瘤特异性增殖型腺病毒，目前最广泛地应用于肿瘤的基因治疗。肿瘤与正常细胞组织因基因结构上的差异，出现了包括代谢、增生、生长等多方面的明显差异。肿瘤细胞复制过程中可以大量分泌出正常细胞无法分泌或者少分泌的物质，条件复制型腺病毒可以利用这些物质对病毒产生特异的靶向性，可在肿瘤细胞内复制增生，达到目的基因蛋白表达，最终杀死肿瘤细胞。鉴于良好的启动活性和肿瘤特异性，Cox-2等启动子越来越成为基因治疗中研究的热点与重点〔1～7〕，并已构建Cox-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒 (Ad-Cox-2-E1A)〔8〕。本文通过荧光素酶报告基因原理，检测Cox-2启动子在实验细胞中的启动活性。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光素酶检测试剂，RNeasy Mini kit，RNase inhibitor，Adeno-XTM Expression System，MTT 试剂盒，病毒基因组提取试剂盒，RNA提取试剂盒，DMEM medium，HEK293细胞组，anti-Cox-2抗体，anti-E1A抗体，Western印迹试剂等。

1.2 方法

1.2.1 重组条件复制性腺病毒的获得

1.2.1.1 重组腺病毒质粒的构建及鉴定 本实验所用的腺病毒载体为人血清5型腺病毒，重组腺病毒质粒Ad-Cox-2-E1A经酶切和测序鉴定。PCR Cox-2 promoter的模板为Hela细胞基因组，引物为:同义引物:5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAGGTACCTGGTGTAGTTTTA-3'，反义引物:5'-GAATTCGCTAGCCGCTGCTGAGGAGTTCC-3'。PCR E1的模板为HEK293细胞基因组，引物为:E1-1同义引物:5'-CCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCAC-3'，E1-1，反义引物:5'-GTATTCCTCCGGTGATAAT-3';E1-2同义引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反义引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3';E1-3同义引物:5'-GTACCTGCTGGATTTTCTG-3'，反义引物:5'-ACCCATAGAAGCTTACACC-3';E1-4同义引物:5'-GGTGTAAGCTTCTATGGGT-3'，反义引物:5'-CCGGAATTCGTCGACGCTGCTGCAAAACAG ATA C-3'。

1.2.1.2 重组腺病毒的鉴定 PCR法鉴定:用病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组，PCR腺病毒基因组E2b特异性片段鉴定腺病毒。同义引物:5'-tcgtttctcagcagctgttg-3'，反义引物:5'-catctgaactcaaagcgtgg-3'。PCR E1基因鉴定外源基因，同义引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反义引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3'。……