李树春， 王 槐， 王桂萍， 满序聪

(中央民族大学，中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

Endophilin 3是一种包含BAR结构域的蛋白，它参与网格蛋白介导的囊泡转运［1］。我们实验室以endophilin3的N端保守区+可变区(C+V区)为诱饵，应用酵母双杂交的方法从小鼠睾丸cDNA文库中筛选获得了一个编码结合蛋白的新基因，命名为mRSD－9。该基因全长为575 bp，开放读码框534 bp，编码一个含177个氨基酸的蛋白质，获得Gen-Bank接受号为AY278322。本实验对mRSD－9蛋白和endophilin 3的相互作用进行验证，并对该基因功能进行初步研究。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株 E.coli DH5，用于质粒的扩增与转化。基因型:F－φ80dlacZΔM15 recA1 endA1 gyrA96 thi－1 hsdR17(rk－mk+)supE44 relA1 deoRΔ(lacZYA －argF)U169购自天根生化科技有限公司。

1.2 细胞株 CHO细胞系是本室保存，293T细胞系购自ATCC。

1.3 质粒载体 pGEM－T载体:用于PCR产物的克隆(Promega);pEGFP－N1:用于基因的真核表达(BD Biosciences);pDsRed1－N1:用于基因的真核表达(BD Biosciences);pcDNA6/V5－HisB－FLAG/HA/Myc(Invitrogen):用于基因的真核表达。

1.4 抗体 Endophilin 3和mRSD－9多抗为本实验室制备。Flag和Myc单抗、Anti－Flag M2 Agrose购自Sigma。FITC和TRITC标记的抗小鼠IgG购自中衫生物技术公司。

1.5 工具酶及试剂 DL2000 DNA marker、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶Klenow片段、RNase A以及各种限制性内切酶均为TaKaRa(大连)有限公司产品。IPTG和 X－gal购自Boehringer－mannheim;丙烯酰胺、N'，N'－ 亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、SDS等均购自Bio－Rad;Tris和尿素等购自Gibco－BRL;各种蛋白酶抑制剂均为Sigma产品;细胞培养所用的DMEM和RPMI－1640购自Gibco－BRL，胎牛血清购自HyClone。胰蛋白酶购自Gibco－BRL。小规模转染所用Lipofectamine 2000购自Invitrogene。其它各种试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.6 主要仪器及设备 冷冻高速离心机(Beckman)、Eppendorf台式冷冻离心机、MilliQ Plus超纯水系统(Millipore)、PCR 仪(MJ research Inc.)、蛋白质垂直电泳仪(Bio－Rad)、酶标仪(Bio－tech Instruments Inc.)、紫外观测仪及照相系统(UVP Inc.)、荧光显微镜及照相系统(Nikon)、激光共聚焦显微镜(LEICA，TCS NT)等。

2 方法

2.1 质粒载体的构建［2］用PCR扩增mRSD－9及endophilin 3 cDNA序列，引物设计时在上、下游引物的5'端分别加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点及HindⅢ和EcoRⅤ酶切位点。……