刘瑞霞， 郭 兵， 王圆圆， 肖 瑛， 石明隽， 张国忠

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州贵阳550004)

我们前期研究发现，核转录共抑制因子SnoN(Ski－related novel protein N)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾小管－间质纤维化发病过程中可能起着重要作用[1－3]。但在 DN 发病中，有关SnoN与肾小管－间质纤维化之间存在怎样的关系，与肾小管－间质纤维化的哪些成份有关，国内外尚未检索到相关的报道。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要成份，而ECM的过度沉积是DN肾小管－间质纤维化的基本病理改变。因此，我们通过动态观察SnoN和FN在高糖培养大鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)中的表达变化;并通过siRNA技术敲低肾小管上皮细胞中SnoN的表达，再观察FN的表达情况，初步探讨SnoN与DN肾小管－间质纤维化发病的关系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 低糖DMEM培养基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco);转铁蛋白(Sigma);抗 SnoN、SnoN siRNA、siRNA transfection reagent、fluorescein － conjugated control siRNA、siRNA transfection medium、siRNA dilution buffer、SnoA/N(m)－PR和抗上皮性钙黏蛋白(E－cadherin)(Santa Cruz);抗角蛋白－18(cytokeratin－18，CK－18)、抗 α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin，α －SMA)、抗 FN、抗 β －actin、DAB、浓缩型SABC－FITC免疫检测试剂盒、生物素标记羊抗兔IgG和生物素标记羊抗小鼠IgG(博士德);总RNA提取试剂盒、蛋白质marker、2×Taq PCR Master Mix和600 bp DNA marker(天根);PVDF膜和3 mm Whatman滤纸(Millipore);RevertAidTMFirst Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas);ECL显色剂(Pierce)。

1.2 动物 雄性 Sprague－Dawley(SD)大鼠，清洁级，鼠龄20 d，由贵阳医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代RTECs培养 SD大鼠股动脉放血处死后无菌取肾，分离、剪碎肾皮质，80目、100目网筛分离肾小管节段;加入0.25% 胰蛋白酶，37℃水浴消化25 min;不含血清的培养基终止消化，生理盐水洗3次，离心弃上清;加入含有10%FBS的低糖DMEM培养液，接种于25 cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱培养。72 h后全量更换培养液，生长近融合时以1∶2传代，经鉴定为RTECs后继续培养，实验采用第3代细胞。……