张卫华 高 峰 (郑州市中牟县人民医院检验科，河南 郑州 45450)

视神经脊髓炎(NMO)是一种自身免疫性疾病〔1〕，患者血清中存在特异性自身免疫性抗体NMO-IgG〔2〕，该抗体能够与水通道蛋白-4(AQP4)特异性结合，目前对该特异性抗体的检测已被纳入 NMO诊断标准〔3〕。本研究拟通过构建稳定表达AQP4抗原的HEK293细胞株，建立以其为底物的间接免疫荧光方法，检测NMO患者血清中抗AQP4抗体，并与酶联免疫吸附(ELISA)法进行比较，为NMO的血清学诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年Balb/c小鼠由河南省动物实验中心提供。菌株 DH5α及HEK293细胞株购自Gibco公司，质粒pcDNA3.1为本室保存。血清标本取自郑州大学第一、二附属医院和河南省人民医院神经内科及眼科2010年1～10月住院患者，其中按照Wingerchuk等制定的NMO诊断标准(2006年修订版本)临床确诊NMO患者15例(男4例，女11例，平均41岁)，按照McDonald2005年诊断标准临床确诊典型多发性硬化患者36例(男21例，女15例，平均34岁)，其他神经内科及眼科病例30例(男14例，女16例，平均45岁)。对照血清标本由本室提供，均为英国RSR公司AQP4抗体ELISA检测试剂盒重复检测3次后，确定的AQP4抗体阳性和阴性血清。

1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRI、NotI、T4DNA连接酶和RT-PCR试剂为TakaRa公司产品，质粒提取试剂盒为Vegen公司产品，RPMI1640为Gibco产品，Trizol及LipofectamineTM2000购自Invitrogen，兔抗AQP4多克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔及山羊抗人IgG购自北京中杉金桥公司，AQP4自身抗体ELISA检测试剂盒购自RSR公司。

1.3 AQP4基因的获取 无菌状态下取健康成年小鼠脑皮质，用Trizol试剂提取总RNA，并采用随机引物将RNA逆转录成cDNA，参照Genebank公布的AQP4序列(U14007)进行引物设计:上 游 引 物:5'-TATCGAATTCATGAGTGACGGAGCTGCAGCGAGGCGGTGG-3';下游引物:5'-TATGCGGCCGCTCATACAGAAGATAATACCTCT-3'。……