张 庆 彭明勇 马 敏 (宁夏回族自治区第三人民医院口腔科，宁夏 银川 7500)

牙周炎是一种由多因素引起的感染性疾病，牙周细菌和机体防御机能的相互作用决定疾病的过程和进展〔1〕。维生素D受体(VDR)在维持机体钙、磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面起着重要的作用。关于VDR基因多态性的研究，目前发现与个体生长发育及人类疾病相关的基因多态性分别对应限制性内切酶TaqⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ的酶切位点。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，探讨VDR基因TaqⅠ位点单核苷酸多态性与宁夏回汉人群中重度CP的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集病例组178例患者2007年10月至2009年10月就诊于宁夏医科大学附属医院口腔科的患者和健康对照者187例(健康志愿者)。以上研究对象均为宁夏本地人群，并且均知情同意参加本实验，签署知情同意书。病例组纳入标准:3代均为汉族或回族，未与其他民族通婚;口内至少有14颗牙存在其中包括4颗磨牙(不含第三磨牙);无明显的错牙合畸形及不良修复体等;无糖尿病、心血管病等系统性疾病;不吸烟或戒烟5年以上;全口至少3个象限内，每1象限内至少有两颗牙齿的探诊深度(PD) ＞4 mm、附着丧失(CAL)≥3 mm;X线显示牙槽骨吸收≥根长的1/3。对照组纳入标准:3代均为汉族或回族，未与其他民族通婚，牙周健康，全身健康无系统性疾病。由同一名医师对所有受检者进行全口牙周检查，记录口腔中所有余留牙的6个位点的牙周袋深度(probing depth，PD)及临床附着丧失(clinic attachment loss，CAL)，参照ARMITAGE等〔2〕推荐标准:健康对照组:平均CAL≤0.5 mm，无邻面位点CAL≥3 mm;缺失牙≤2颗(第三磨牙、正畸拔牙、外伤性失牙、大面积龋坏失牙及先天性缺失牙除外)。对病例组和对照组的年龄和性别分布进行χ2检验，各组一般资料比较均无统计学差异，见表1。

1.2 主要试剂 血液基因组 DNA提取试剂盒、2×Taq PCRMasterMix、DNA markerⅠ(北京 TIANGEN 公司)、引物由北京奥科生物技术有限公司合成(F:5'-GGAGAAGTCACTG-GAGGGC-3'，R:5'-GGATCATCTTGGCATAGAGC-3'〔3〕)、Taq Ⅰ限制性内切酶(MBI公司提供)、PCR仪、电泳仪、全自动凝胶图像分析仪，电热恒温水浴箱、台式离心机。

表1 各组年龄性别比较(n)

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取外周静脉血5 ml，采集管中加入EDTA抗凝，4℃保存。采用上述DNA提取试剂盒提取外周血总基因组DNA，－20℃保存。

1.3.2 PCR 扩 增 模 板 DNA 2 μl，dNTP 2.5 μl(2.5 mmol/L)，10 × 缓冲液 2.5 μl(含 Mg2+)，引物 S、A 各1.0 μl(15 pmol/L)，TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，用无菌去离子水补足总体积至25 μl。反应条件为:预变性94℃ 5 min;94℃30 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35 个循环，最后 72℃延伸 5 min。扩增片段长度为307 bp。

1.3.3 TaqⅠ酶切 酶切总体系20 μl，其中PCR扩增产物8 μl，相应缓冲液 1.5 μl，TaqⅠ内切酶 1 U，加无菌去离子水补足总体积，于37℃水浴消化过夜。不含TaqⅠ(T^CGA)酶切位点，只出现307 bp一个片段;含有该酶切位点，被切成2个片段(209 bp、98 bp)。

1.3.4 多态性分析 取酶切产物10 μl，用2.5%的琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳，凝胶成像分析系统观察结果并分析基因型。分型标准:CC基因型为307 bp 1个片段，CT基因型为307、209、98 bp 3 个片段，TT 基因型为209 bp、98 bp 2 个片段。

1.3.5 PCR质量控制措施 所有实验标本的测定均在盲法下进行，并随机抽取10%样本作重复性实验，检测PCR结果的可靠性。随机选择10%的标本进行PCR扩增后直接测序，以验证酶切所得的基因型数据结果的准确性。

1.4 统计学分析 (1)Hard-Weinberg Equilibrium分析(H-W平衡):本研究应用H-W平衡软件计算基因型的分布，P＞0.05，则说明研究人群符合 H-W 平衡。(2)病例-对照分析(Case-Control Test):用SPSS13.0统计软件处理数据，采用 χ2检验，对病例组和对照组的一般资料(年龄、性别)及两组基因型和等位基因频率的分布进行比较。

2 结果

样品提取、PCR扩增和酶切均获成功，基因型测定的典型电泳结果见图1，测序图见图2。回、汉族两组VDR基因TaqⅠ位点基因型和等位基因频率的分布见组间有显著差异(均P＜0.05)，但两民族的CP组基因型和等位基因频率分布无差异(χ2=0.074，P=0.785;χ2=0.072，P=0.788)，表2、表3。

图1 VDR基因rs731236位点限制性片段长度多态性

图2 VDR基因TaqⅠ(rs731236)位点测序结果

表2 回族TaqⅠ(rs731236)位点基因型及等位基因频率的分布〔n(%)〕

表3 汉族TaqⅠ(rs731236)位点基因型及等位基因频率的分布〔n(%)〕

3 讨论

牙周炎是发生在牙周支持组织上的慢性感染性疾病，是造成老年人失牙的最主要的原因〔3〕。其发病率因国家、地区和种族的不同而有所差别〔4〕并且早期临床表现不明显，就诊时牙周组织往往已经发生了不可逆的变化，进而严重影响牙合系统的完整性和咀嚼功能，同时牙周炎会成为病灶影响全身的健康及加重一些全身疾病的进展。随着我国进入老龄化社会，牙周病将成为突出的健康问题。

Michalowicz等〔5〕采用遗传学经典双生子法揭示遗传因素与牙周炎的发生、发展存在重要关系和近些年流行病学深入研究的双重影响下，越来越多的证据表明不同宿主对牙周炎的易感性有很大差异，某些基因的遗传多态性影响着牙周炎的发生、发展。文献报道与牙周炎易感性有关的基因有:白细胞介素-1基因(IL-1)、VDR基因、肿瘤坏死因子α基因(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMPs)等。牙周炎的主要症状之一就是牙槽骨的吸收，牙槽骨是全身骨骼系统的一部分，也是全身骨骼系统中变化最为显著的部分，其变化与牙齿的发育、萌出及乳、恒牙的替换、咀嚼功能的发挥和牙齿的移动等有关系。该变化反映出骨组织的改建过程，即破骨和成骨两者相互平衡的生理过程〔6〕。VDR基因直接与骨密度代谢有关，成为研究CP的一个热点基因。

在我们的研究结果中:汉族和回族CP组及对照组均未出现TT基因型，这可能与TT基因型在中国汉族人群中的携带率低等因素有关，还可能与样本量较少有关。我国汉族人群TT基因型频率为0.6%，与韩国人的分布频率相似〔7〕，而远低于白种人的分布频率(TT基因型频率均为10% ～17%)〔6〕。关于TaqⅠ位点与CP的研究，国内外学者在不同地区对不同种族的人群进行了大量研究，结论有较大分歧。Nibali等〔8〕对英国79名CP和231名健康对照者进行了研究;de Brito等〔9〕、Borges等〔10〕在巴西人群中分别进行了研究;Tachi等〔11〕、Kobayashi等〔12〕在日本人群中分别进行了该位点的研究;国内王春先等〔13〕也进行了该点的研究，他们的研究结果提示TaqⅠ SNP位点可能与CP的易感性有关。本研究结果同以上学者的研究结果一致，但与 Gunes等〔14〕、Sun 等〔15〕、还有章锦才等〔16〕的研究结果不同。对于研究结果的不一致可能与不同地区、不同种族的遗传特征不同有关，还可能与样本量大小有关〔17〕。

关于TaqⅠ位点多态性的作用机制问题，有学者认为:在基因的翻译、表达过程中，蛋白质的合成受mRNA 3'末端非翻译区的调控，该区域的内在特性影响着mRNA的稳定性，它对RNA酶特别敏感，VDR基因TaqⅠ的酶切位点正位于该区域，如果该区域的碱基有任何改变，都会影响VDR基因的调控而影响VDR的表达，如改变受体的数量，影响增强子对靶位的亲和力或影响与维生素D的亲和力〔18〕。

慢性牙周炎是多因素引起的炎症性疾病，微生物是其发生的始动因子，某些全身性疾病、遗传、环境和行为因素等也可能是其发病的危险因素。VDR基因直接与骨代谢有关，不同地区、不同民族的遗传学特征可能存在明显差异。所以对于VDR基因多态性与CP之间的关系还需要在不同地区、不同民族之间进行更大样本的研究，并进行以家系为基础的关联研究，还要与其他可能的易感基因进行连锁分析。

1 Offenbacher S.Periodontal disease:pathogenesis〔J〕.Ann Periodontol，1996;1:827-78.

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4 曹采方.牙周病学〔M〕.第2版.北京:人民卫生出版社，2003:127-8.

5 Michalowicz BS.Genetic and heritable risk factors in periodontal disease〔J〕.J Periodontol，1994;65(5):479-88.

6 Kribbs PJ，Cheanut CH，Ott SM，et al.Relation between mandibular and skeletal bone in a population normal women〔J〕.J Prosth Dent，1990;63(1):86-8.

7 Schwartz BS，Lee BK，Lee GS，et al.Association of blood lead，dimercaptosuccinic acid-chelatable lead，and tibia lead with polymorphisms in the vitamin D receptor and(delta)-aminolevulinic acid dehydratase gene〔J〕.Environ Health Perspect，2000;108:949-54.

8 Nibali L，Parkar MD，Aiuto F，et al.Vitamin D receptor polymorphism(+1056 TaqI)interacts with smoking for the presence and progression of periodontitis〔J〕.J Clin Periodontol，2008;35(7):561-7.

9 de Brito RB Jr，Scare-Caminaga RM，Trevilatto PC，et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene are associated with periodontal disease〔J〕.J Periodontol，2004;75(8):1090-5.

10 Borges MA，de Figueire do LC，Brito RB Jr，et al.Microbiological composition associated with vitamin D receptor gene polymorphism in chronic periodontitis〔J〕.Braz Oral Res，2009;23(2):203-8.

11 Tachi Y，Shimpuku H，Nosaka Y，et al.Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with chronic periodontitis〔J〕.Life Sci，2003;73(26):3313-21.

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13 Wang C，Zhao H，Xiao L，et al.Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and severe chronic periodontitis in a Chinese population〔J〕.J Periodontol，2009;80(4):603-8.

14 Gunes S，Sumer AP，Keles GC，et al.Analysis of vitamin D receptor gene polymorphisms in patients with chronic periodontitis〔J〕.Indian J Med Res，2008;127(1):58-64.

15 Sun JL，Meng HX，Cao CF，et al.Relation between vitamin D receptor gene polymorphism and periodontitis〔J〕.J Periodont Res，2002;37(4):236-67.

16 章锦才，耿华欧，马文波，等.维生素D受体基因多态性与汉族人群慢性牙周炎易感性的关系〔J〕.中华口腔医学杂志，2005;40(1):50-3.

17 Yoshie H，Kobayashit，Taih，et al.The role of genetic polymorphisms in periodontitis〔J〕.J Periodontol，2007;43:102-32.

18 Garcia-Lozano JR，Gonzalez-Escribano MF，Valenzuela A，et al.Association of vitamin D receptor genotypes with early onset rheumatoid arthritis〔J〕.Eur J Immunogenet，2001;28(1):89-93.