刁 然， 夏靖燕， 徐 峰△， 程玉生， 杨 燕， 王选锭

(浙江大学医学院附属二院1呼吸科，2肿瘤放疗科3感染管理科，浙江 杭州 310009)

大量研究证实不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重最重要的病原体［1］。肺部感染 NTHi后，导致中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞在气道和肺实质的聚集和炎症细胞因子释放，造成肺实质损伤，甚至引起组织的破坏和重构，从而促进COPD的发生发展。因此研究NTHi所诱导的炎症反应过程对COPD的防治具有重要意义。目前有关NTHi分子发病机制研究多采用小鼠模型或体外细胞模型。建立人肺组织体外感染模型来研究细菌与肺组织互相作用的细胞和分子机制，将更能反映人体内的真实情况。本研究将利用人NTHi肺组织体外急性感染模型(acute NTHi infection model，AHIM)来阐明 Toll样受体2(Toll－like receptor 2，TLR2)－p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK)－ 核因子 κB(nuclear factor κB，NF － κB)信号通路在介导细菌炎症反应中的作用。

材料和方法

1 主要材料

NTHi为浙江大学医学院附属第二医院检验中心的临床分离株［1］;羟乙基哌嗪乙磺酸－谷氨酸介导的具有保护作用的有机溶剂(HEPES－glutamic acid buffer－ mediated organic solvent protection effect，HOPE)为德国Borstel研究中心赠送;RPMI－1640为Gibco产品;TLR2单抗购自Imgenex;GAPDH抗体购自eBioscience;SB203580(p38 MAPK抑制剂)购自Calbiochem;PDTC(NF－κB抑制剂)购自Sigma;电泳迁移率检测(EMSA)试剂盒购自Pierce;酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自R＆D。

2 体外肺组织NTHi感染模型

从5例因肺部孤立肿块而接受胸科手术的成年患者的手术标本中切取距肿块5 cm外的正常肺组织。肺组织块大小约1 cm×1 cm×1 cm。置于24孔组织培养板中培养。每块肺组织加入800 μL的RPMI－1640培养液。肺组织块与1010CFU/L的NTHi置37℃、5%CO2培养箱共孵育4 h和24 h后，组织块置于HOPE溶液中4℃固定48 h。……