廖 燕 林书瀚 黎丹戎 利基林 唐东平 唐 凯 张力图

SLC30A9(solute carrier family 30 member 9)又名GAC63，是一个与DNA修复相关的基因［1］，其大部分功能未知。SLC30A9定位于4p13，在以往的研究中，大约50%膀胱癌被证实在4p13的4个区域存在杂合性缺失［2］，在其它的人类肿瘤包括子宫颈癌［3］、胃腺癌［4］和 BRCA1突变的肿瘤中［5］，通过扫描肿瘤组织染色体区域发现，4号染色体短臂存在频繁的杂合性缺失，提示该区域的基因可能与肿瘤的发病有关。近年来发现，SLC30A9可以与β-catenin相互作用，影响Wnt信号通路的激活［6］，而Wnt信号通路与多种肿瘤的发展相关［7］。我们从生物信息学分析得到SLC30A9在乳腺癌组织和正常乳腺组织中存在差异性表达，因此，本研究以RT-PCR技术探讨SLC30A9在乳腺癌组织中的表达情况，为进一步分析SLC30A9与肿瘤发生的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象与标本保存

30例乳腺癌标本取自2004年12月至2005年6月在广西医科大学附属肿瘤医院住院的手术病例。患者均为女性，年龄30～74岁，中位47岁。其中浸润性导管癌25例，低分化腺癌2例，乳头状癌1例，黏液腺癌1例，导管内癌1例。有淋巴结转移19例，无淋巴结转移11例。所有病例均经病理检查确诊，分别收集30例乳腺癌癌灶组织、30例癌旁组织和10例相应的正常乳腺黏膜组织(距离病灶5cm以上且无癌浸润者)。期间还收集了20例乳腺良性病变组织。这些组织分别离体后，10min内投入液氮速冻，然后转移至-80℃超低温冰箱冻存备用。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol总RNA抽提试剂由Invitrogen公司提供，逆转录试剂盒及Taq酶、RNAse-free水等试剂由Promega公司提供。引物设计采用Primer 5软件设计，引物合成由上海博亚生物技术有限公司完成。仪器主要为美国PTC2000型多通道PCR仪、美国PE公司PX2型高性能PCR仪，美国Bio-Rad Gel DOC2000型凝胶成像分析系统。

1.3 RNA的提取

1.3.1 物品和试剂的特殊准备:将清洁的金属器械和泡酸晾干的玻璃器皿放入烤箱，180℃以上高温烘烤5h，以灭活RNA酶，不耐高温的塑料和橡胶制品用配好的1‰DEPC液浸泡12h以上，捞起装盒、打包，高压蒸汽灭菌后烘干备用。所用的溶液均用RNAsefree DEPC水配制。

1.3.2 抽提总RNA的步骤 利用TROZOL一步法提取。

1.3.3 总RNA的鉴定 测定RNA的浓度和纯度:取5μl RNA液加入195μl Rnase-free DEPC水稀释40倍，用双光束紫外分光光度仪(超薄石英杯)测定λ260nm和λ280nm的吸光度值(OD值)，根据公式计算浓度CRNA(μg/ml)=OD260×40×40÷1 000，根据OD260/OD280比值反映RNA纯度，所有样本的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间，说明提出的RNA纯度较高，符合标准。

总RNA的电泳鉴定:用1%琼脂糖凝胶电泳1h，琼脂糖凝胶用凝胶成像分析系统扫描，观察若有28S、18S两条带出现，5S条带很微弱，加样孔内无明显DNA残留，说明所提取的总RNA符合要求。

1.3.4 逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR) 按照A3500型逆转录试剂盒(美国Promega公司)实验操作步骤进行。在进行逆转录前先去除RNA中可能存在的痕量DNA。

1.3.5 多聚酶链式反应(PCR) 所用引物为:F-5'GCC AAT TGC ATG GGC CTT AGT TC 3'R-5'TGC CCT TAC TGA TCG GTC ATT CTC C 3'10μl反应体系。PCR反应条件为94℃变性30s、65℃复性30s、72℃延长1min，30次循环。

1.3.6 RT-PCR结果判定 1.6%的琼脂糖凝胶电泳验证，凝胶电泳成像系统成像，测算出相应的光密度比值(SLC30A9 mRNA与GAPDH mRNA之比)。凝胶电泳分析软件(BIORAD公司Quantity one软件)分析测定其光密度，各电泳条带净密度值按下列公式计算:净密度值=(平均密度-背景密度)×面积。以所扩GAPDH密度作为内参照，以目标基因净密度与GADPH净密度的比值进行半定量比较。

1.4 统计学处理

用SPSS10.0 for windows软件对数据进行统计学分析。计数、计量资料分别做t检验和χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC30A9 mRNA的表达水平

全组90例乳腺组织样品中均有SLC30A9 mRNA表达。在30例乳腺癌患者中，5例(4、9、10、12号和13号)患者的癌组织、癌旁组织及正常组织中均存在SLC30A9基因mRNA差异性表达，占16.7%(5/30)。4、9号和12号患者的癌组织中，SLC30A9的表达比相应的正常组织低，而10号和13号患者则表现出在癌组织中表达上调。SLC30A9 mRNA在乳腺癌组织、癌旁组织、正常乳腺组织和乳腺良性病变组织的表达情况。见图1-3。

图3 乳腺癌(T)、乳腺良性病变组织(B)SLC30A9基因mRNA表达的琼脂糖电泳图

从组间分析来看，SLC30A9基因mRNA在30例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织和10例正常乳腺组织及20例乳腺良性病变组织中均有表达。其平均光密度比值分别为0.443±0.247、0.427±0.253、0.405±0.209、0.547±0.190。上述4组分别两两比较，SLC30A9 mRNA表达水平的差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 乳腺癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织SLC30A9 mRNA表达水平比较)

表1 乳腺癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织SLC30A9 mRNA表达水平比较)

组织类型 n SLC30A9 mRNA P乳腺癌组织 30 0.443±0.247乳腺癌癌旁组织 30 0.427±0.253正常乳腺组织 10 0.405±0.209乳腺良性病变组织 20 0.547±0.190＞0.05

2.2 乳腺癌组织SLC30A9 mRNA的表达与各临床病理因素的关系

乳腺癌组织中SLC30A9 mRNA的平均光密度比值在不同年龄、临床分期、病理类型、淋巴结转移及远处转移的组间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 SLC30A9 mRNA在癌组织中的表达与各临床病理因素的关系

3 讨论

本研究利用半定量RT-PCR法对30例乳腺癌的癌组织及其相应的癌旁组织、10例正常乳腺组织和20例乳腺良性病变组织进行SLC30A9 mRNA表达水平的检测。结果发现SLC30A9基因mRNA在90例乳腺组织样品中均有表达。对其平均光密度值进行比较，组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。即从整体组间的比较来看，没有差异性表达，提示SLC30A9对乳腺癌的发生不是一个主要的因素。但研究发现，肿瘤的发生是多个基因相互作用的过程，大多数涉及的基因只起着部分作用。在突变扫描的研究中，往往只在大量的目的标本中发现极少部分的突变。因此，在筛选疾病基因的过程中我们更应注重个体的差异。在本实验中，我们发现5例标本在癌组织、癌旁组织及正常组织中存在表达异常，占16.7%(5/30)，其中，有3例癌组织SLC30A9的表达比相应的正常乳腺组织低，而其他2例则表现出在癌组织中表达上调。实验结果提示在这些标本中存在有基因突变的可能，这有待于突变扫描的结果证实。也可能该基因的表达调控出现误差，造成表达的不稳定。提示SLC30A9基因可能不是乳腺癌主导基因，但有可能起部分作用或与其他因素共同作用。

将30例乳腺癌患者按不同年龄(是否≥45岁)、临床分期的早晚(Ⅰ/Ⅱ期或Ⅲ/Ⅳ期)、病理类型(浸润性导管癌、黏液腺癌、低分化腺癌、乳头状癌、导管内癌)、有无淋巴结转移和远处转移进行分组后，分别在不同组别间比较癌组织SLC30A9 mRNA表达水平，差异均无统计学意义。提示SLC30A9 mRNA与乳腺癌患者不同年龄、临床分期、病理类型、有无淋巴结转移和远处转移等无关。

由于我们发现在一些标本中SLC30A9的表达有上调，而一些标本中有下调，因此我们用生物信息学的方法分析基因的microRNA(miRNA)调控情况，发现在SLC30A9的3'端非翻译区存在有miRNA的结合位点，这说明该基因可能受mRNA的调控。这提示我们需要做该基因的miRNA结合位点的扫描分析，观察是否存在基因突变从而影响表达。目前发现，大约有30%的人类基因表达可以被miRNA调控，而miRNA的调控与肿瘤的发生相关［8～10］。有关方面值得深入研究。

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