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(广西壮族自治区人民医院,南宁 530021)

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)可早期反映细胞DNA氧化损伤,被认为是一种前景较好的肿瘤监测性指标[1]。NF-κB信号传导通路基因多态性与肿瘤的关系是目前研究的热点[2]。2008年 9月～2010年 9月,本研究检测了肝癌患者尿 8-OHdG,同时选取 NF-κB信号传导通路上 TNF-α(G-308A)、NF-κB(-94ins/delATTG)、iNOS(C608T)、COX-2(T8473C)位点为研究对象,检测肝癌患者 NF-κB信号传导通路相关基因的多态性,观察了不同基因表型肝癌患者尿 8-OhdG水平变化。现报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 肝细胞癌患者 155例(肝癌组),男 130例,女 25例,年龄为 23～62岁。所有患者均经过术后或体外穿刺病理学检查确诊。健康体检者151例,男 130例,女 21例 ,年龄 25～ 64岁 。

1.2 方法

1.2.1 肝癌组 NF-κB信号传导通路相关基因多态性的检测 PCR限制性片段长度多态性检测(RFLP)法。患者空腹采血 5m l,以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝保存,离心分层后取中间层多核细胞,DNA抽提试剂盒提取基因组 DNA。各位点的 PCR引物和限制性内切酶设计参照文献[3～5]。PCR反应体系的总体积为 25μl。反应条件:95℃预变性 2 min、94℃变性 15 s、62℃退火 30 s、72℃延伸 30 s,共 35个循环。PCR产物经限制性内切酶处理后行1%～3%琼脂糖凝胶电泳,根据酶切后的条带判定不同的基因多态性类型:TNF-α(G/G:107 bp;A/G:107、87、20 bp;A/A:107、87、20 bp);NF-κB(I/I:250 bp;I/D:250、200 bp;D/D:200 bp);iNOS(C/C:113、175 bp;C/T:113、142、175 bp;T/T:113、142 bp);COX-2(T/T:147 bp;T/C:147、124、23 bp;C/C:124、23 bp)。

1.2.2 尿 8-OhdG的检测 采集两组晨尿约 50m l于 -80℃冷冻保存,解冻震荡混匀后以 12 000 g/min离心 5min,取上清 100μl。以 ELISA法检测尿8-OHdG,按试剂盒说明书操作。每份尿样做 2个平行样,以尿中的肌酐水平较正 8-OHdG浓度(苦味酸法检测)。

1.2.3 统计学方法 采用 SAS9.1统计软件。计数资料采用 χ2检验;相关性分析采用非参数分析和多因素分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组与对照组尿 8-OHdG水平比较 肝癌组患者尿样品中均可检测出 8-OHdG,为(9.29±8.04)ng/mg Cr,对照组为(7.27±5.06)ng/mg Cr,两组相比,P＜0.05。

2.2 NF-κB信号传导通路相关基因不同表型患者尿8-OHdG水平 TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2基因不同表型组间 8-OHdG水平相比,P＞0.05。详见表1。

表1 NF-κB信号传导通路相关基因不同表型患者尿8-OHdG水平(ng/m g C r)

3 讨论

有研究显示,HBV、HCV感染、黄曲霉毒素 B1(AFB1)暴露、慢性酒精中毒等因素与肝癌发病有密切关系,上述危险因素可增加细胞内氧自由基(ROS)生成而攻击大分子物质,同时激活炎症信号传导通路产生下游的级连反应,NF-κB信号传导通路是其中重要的一条。这些通路被激活可促使炎症反应加强,产生更多 ROS。过度氧化应激导致的氧化损伤可能是肿瘤发病的一个共同特征。研究[6]认为,慢性炎症可能促进了肿瘤的发生和发展。氧化应激状态可加重细胞大分子物质的氧化损伤,如DNA损伤等。已存在 DNA损伤或发生基因突变的增殖细胞在富含炎症细胞和多种生物因子的微环境中持续失控性增殖,最终导致癌变[6]。

DNA在 ROS作用下形成 8-OHdG,其具有致突变性,在 DNA复制过程中可以与双链上C以外的碱基配对形成点突变,其中 GC→TA突变被证实为恶性肿瘤的重要发病机制之一[1,2]。目前 8-OHdG的检测方法较多,尿 8-OHdG检测不易受饮食等因素影响,采集尿样标本方法简单,且样品容易保存和分析[7]。本研究结果显示,肝癌组尿 8-OHdG水平高于对照组,与已有的不同地区健康人群检测结果相比也明显偏高[8],这可能与广西地区肝癌人群中黄曲霉毒素的高暴露率和高乙肝感染率有关[9]。本研究对 NF-κB信号传导通路中四个重要因子——TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2的基因多态性进行分析。其中,TNF-α(G-308A)变异基因位点出现的频率(14.73%)、NF-κB(-94ins/delATTG)变异等位基因的出现频率(64%)均高于国内外学者的报告[1,2,10～12];iNOS(C608T)变异等位基因的出现频率(31.27%)及 COX-2(T8473C)变异等位基因的出现频率(31.09%)与相关研究[5]类似。本研究中,NF-κB信号传导通路相关基因不同型别间患者尿 8-OHdG水平无明显差异。但我们认为这并不能说明两者之间没有关系,因为基因多态性导致的变化只是复杂代谢通路上极其微小的改变,基因多态性通常被认为是个体基因水平上的变异,只意味着单个基因序列的改变,在基因组序列中占极少的部分。同时,基因多态性也只是众多基因水平改变中的一种。所以,单个基因多态性能否决定生物学标志物的改变还要决定于其他相关因素,如基因多态性产物与细胞内化合物的相互作用等。

[1]Yano T,Shoji F,Baba H,et al.Significance of the urinary 8-OHdG level as an oxidative stress marker in lung cancer patients[J].Lung Cancer,2009,63(1):111-114.

[2]Valavanidis A,Vlachogianni T,Fiotakis C.8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG):A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis[J].JEnviron Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev,2009,27(2):120-139.

[3]He Y,Zhang H,Yin J,et al.IkappaBalpha gene promoter polymorphisms areassociated with hepatocarcinogenesis in patients infected with hepatitis B virus genotype C[J].Carcinogenesis,2009,30(11):1916-1922.

[4]Duarte I,Santos A,Sousa H,et al.G-308A TNF-alpha polymorphism isassociated with an increased risk of invasive cervical cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,334(2):588-592.

[5]Karban AS,Okazaki T,Panhuysen CI,et al.Functional annotation of a novel NFKB 1 promoter polymorphism that increases risk for ulcerative colitis[J].Hum Mol Genet,2004,13(1):35-45.

[6]Shen J,Wang RT,Wang LW,etal.A novel genetic polymorphism of inducible nitric oxide synthase isassociated with an increased risk of gastric cancer[J].World JG as troenterol,2004,10(22):3278-3283.

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