马哲龙，蒋福升，俞婷婷，俞 燕，陈建真 ，丁志山

1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053；3.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江杭州 310053

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）为胡桃科山核桃属植物，主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，尤以临安、昌化为佳，具有明显的地域分布特性[1]。山核桃具有广泛的药理作用，山核桃树皮具有清热解毒、抗菌消炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤的作用，山核桃外果皮具有抗炎镇痛、抑菌消炎的作用，山核桃叶片提取物有很好的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌、黄曲霉菌、青霉菌和黑曲霉菌均有效[2-7]。本实验室的前期研究发现山核桃叶提取物有抑制SGC-7901细胞增殖和诱导该肿瘤细胞凋亡的作用[8]。因此，笔者经过对山核桃叶提取物进行分离，并首次从中得到球松素查儿酮（DHMC）。目前有关DHMC药理作用的研究很少，仅少量文献报道DHMC具有选择性抗利什曼原虫的作用[9]，经过进一步研究发现，DHMC不仅对肿瘤细胞有较好的抑制作用，而且还具有抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及舒张血管等作用，可用于进一步开发防治动脉粥样硬化等心血管疾病的药物。目前已报道的含有DHMC的物质很少，且含量不高。本试验建立了HPLC测定山核桃树叶中DHMC含量的方法，为以后进一步开发DHMC的药用价值提供参考。

1 仪器与试药

仪器：Dionex高效液相色谱仪（美国戴安公司）、万分之一精密电子天平（AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA）、KQ-3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率（150 W，频率 40 kHz）。

试药：色谱级甲醇（临海市浙东特种试剂厂）、甲醇（杭州大方化学试剂厂）、水为双蒸水；山核桃叶（采自浙江临安，经浙江中医药大学陈锡林副教授鉴定为山核桃（Carya cathayensis Sarg.）的树叶；对照品：DHMC（实验室自制，经NMR鉴定其结构，HPLC峰面积归一法检测含量为99.4%）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取适量山核桃叶粉碎，过40目筛，称取粉末约0.25 g，精密称定，置于25 ml容量瓶中，精密加入25 ml甲醇，称定重量，超声处理30 min，取出待冷却后，再次称定重量，用溶剂补足减失重量，取续滤液0.5 ml，定容至10 ml容量瓶中，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得山核桃叶供试品溶液。

2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取减压干燥的DHMC对照品5 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.5 mg/ml的对照品贮备溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备液2.0 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，从中吸取5 ml，用甲醇定容至25 ml，摇匀，即得0.004 mg/ml的对照品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（65∶35，V/V），流速为 1.0 ml/min，检测波长为 342 nm，柱温为30℃，进样量为10 μl。在此条件下DHMC达到基线分离。结果见图1。

图1 DHMC对照品和山核桃叶HPLC图谱

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下的对照品贮备液1 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2、4、6、8、10 μl，注入色谱仪进行测定，记录色谱图，以对照品进样量为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），求得回归方程为：Y=7.8868X-0.0409（r=0.9996）。 结果表明，DHMC 进样量在0.02～0.10 μg范围内呈良好的线性关系。标准曲线见图2。

图2 DHMC的标准曲线

2.3.2 精密度试验 精密吸取0.004 mg/ml DHMC对照品溶液10 μl，注入色谱仪，重复进样6次，测定DHMC的色谱峰面积值，求得峰面积的RSD为1.1%（n=6）。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取“2.1.1”项下供试品溶液10 μl，注入色谱仪，按 0、1、2、3、4、5 h 间隔进样，测得 DHMC 的色谱峰面积，求得峰面积的RSD为0.9%（n=6）。结果表明，供试品溶液在室温条件下5 h内基本稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批药材，按“2.1.1”项下的方法平行制备6份供试品溶液并依法测定DHMC的色谱峰面积，求得峰面积RSD为0.9%（n=6），结果表明本法重现性良好。

2.3.5 加样回收试验 取已知DHMC含量的山核桃叶粉碎，过40目筛，称取药材粉末约0.125 g，精密称定，研细，共称取6份， 分别精密加入对照品贮备液 （0.5 mg/ml）1.6、1.6、2.0、2.0、2.4、2.4 ml，再按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，并依法测定，记录色谱峰面积，按外标法计算出DHMC的回收率分别为 99.47%、99.71%、102.5%、101.4%、104.3%、102.3%，平均回收率为 101.6%，RSD=1.8%（n=6）。

2.4 样品含量测定

取“2.1.3”项下的对照品溶液和“2.1.1”项下的山核桃叶供试品溶液各10 μl进样测定，按上述色谱条件测定峰面积，外标法计算含量，结果山核桃叶中DHMC的含量为7.916 mg/g，达 0.79%。

3 讨论

试验过程中采用了100%、80%和60%的甲醇溶液提取，三者均可得到较好的分离效果，且测得的结果无明显差异，鉴于便捷性和稳定性考虑，采用100%甲醇为提取溶剂；在提取方法的选择上，采取超声提取和水浴回流提取两种方法作对比，二者测得的结果无明显差异，从简便和节能上考虑，采用了超声处理法提取；在流动相选择上，对两种洗脱系统进行比较，即乙腈-水（65∶35）、甲醇-水（65∶35），结果显示采用甲醇-水（65∶35）为流动相，峰形与分离效果最好，故选择甲醇-水（65∶35）为流动相。本实验首次对山核桃叶中的DHMC成分进行了方法学考察的研究，对提取时间、提取溶媒、提取方法及HPLC条件进行了筛选，初步为DHMC的质量标准化研究及含量测定建立了可靠简便的方法，也为山核桃叶的开发利用提供了宝贵的资料。

[1]苏秀,马良进,陈安良,等.山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究[J].浙江林学院学报,2008,25(3):355-358.

[2]施宏,丁志山.山核桃属植物的化学成分及药理作用研究进展[J].中成药2009,31(6):924-928.

[3]宛蕾,陈秀芬,杜江.胡桃青皮抗炎及镇痛作用的研究[J].中药药理与临床,1999,15(2):29-30.

[4]孙墨珑,宋湛谦,方归珍.核桃楸叶乙醇提取物的抑菌活性及活性成分分析[J].林产化学与工业,2007,27(21):81-83.

[5]司传领,刘忠,惠岚峰,等.核桃楸树皮提取物的化学成分及其抗氧化活性研究[J].林产化学与工业,2008,28(1):29-32.

[6]林君阳.山核桃外果皮化学成分及抑菌活性研究[D].浙江:浙江林学院硕士学位论文,2008.

[7]王金兰,张淑霞,李铁军,等.山核桃树皮化学成分研究[J].中草药,2008,39(4):490-493.

[8]胡旭姣,赵肖君,周奋,等.山核桃提取物体外抗肿瘤作用研究[J].中华中医药学刊,2007,25(2):369-370.

[9]Eduardo,Caio,Torres-santos,et al.Selective Effect of 2′,6′-Dihydroxy-4′-Methoxychalcone Isolated from Piper aduncum on Leishmania amazonensis[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1999,43(5):1234-1241.