刘清新 ，于永军 ，焦 艳 ，潘海霞

1.沧州医学高等专科学校，河北沧州 061001；2.沧州市药检所，河北沧州 061001

清热醒脑灵片由水牛角、黄芩、黄连、冰片、栀子等十三味药组成，具有清热解毒，开窍醒脑，息风安神之效，可用于脑炎、高血压及各种高热的治疗[1]，并收载于卫生部标准中药成方制剂第八册，于1993年颁布执行。原质量标准中只有显微法鉴别、化学法鉴别及常规检查，未对任何药物或有效成分进行含量测定。本实验采用HPLC法对清热醒脑灵片处方中栀子所含的主要成分栀子苷进行含量测定，为该制剂的质量控制提供科学依据，保障临床用药的安全有效。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪 （G1315B型DAD检测器，G1311A型泵，G1311A自动进样器，G1316A柱温箱），Hypersil ODS2 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TU1810型紫外可见分光光度计；BS124S型电子分析天平；KH-3200DB型超声波清洗仪。

栀子苷对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：110749-200714，供含量测定用），乙腈为色谱纯（天津市光复精细化工研究所），清热醒脑灵片（河北天成药业有限公司生产，批号：20090212、20090310、20090320），阴性样品为自制；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Hypersil ODS2 C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：20℃；检测波长 238 nm；流动相：乙腈-水（15∶85）[2-3]；理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成300 μg/ml的溶液，作为对照品储备液。精密量取上述储备液适量，加甲醇稀释制成30 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约相当于1片重量），置25 ml容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取不含栀子的阴性样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.3 空白干扰试验

取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。见图1。

2.4 线性关系试验

精密量取对照品储备液 1、2、5、8、10、15 ml，分别置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以栀子苷浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标进行线性回归。见图2。

图1 空白干扰试验色谱图

由图1可知，其他原辅料对栀子苷的含量测定无干扰。

图2 线性关系试验

由试验结果可知，栀子苷溶液在6.36～95.40 μg/ml浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，回归方程为A=24.62C+19.77（r=0.9999，n=6）。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果显示，各峰面积的RSD值为0.42%。

2.6 重复性试验

取批号为20090212的样品，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件分别测定含量，共测定5份。结果显示，其平均含量为0.500 mg/片，RSD为0.67%。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，在 20℃条件下，分别于 0、1、2、4、8 h，精密量取20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定栀子苷峰面积。结果显示，各峰面积的RSD值为0.83%，表明供试品溶液在20℃条件下8 h内稳定。

2.8 回收率试验

按2片重量的80%、100%、120%称取供试品细粉，每一浓度称取3份样品，加甲醇25 ml，超声处理30 min，过滤，精密量取续滤液5 ml，精密加入栀子苷对照品溶液5 ml，混匀，作为供试溶液。分别取上述供试品溶液和栀子苷对照品溶液，按照含量测定项下方法测定。见表1。

表1 栀子苷回收率试验结果

由表1结果可知，本法栀子苷回收率较好。

2.9 样品含量测定

取本品样品3批，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件分别测定含量。见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的确定

取浓度为30 μg/ml的栀子苷对照品甲醇溶液，采用分光光度法在200～400 nm的波长范围内进行紫外扫描，结果本品在237.5 nm波长处有最大吸收。参照栀子含量测定项下方法[2]及相关文献报道[3-4]，确定栀子苷含量测定的检测波长为238 nm。

3.2 超声提取时间的选择

参考有关文献报道[5-6]，在制备供试品溶液时，取同一批号样品，以甲醇为溶剂超声提取 10、20、30、40 min，在同一色谱系统及色谱条件下试验，结果各样品的平均含量分别为0.435、0.449、0.494、0.496 mg/片，表明 30 min 时栀子苷基本提取完全，故确定超声提取时间为30 min。

综上所述，本实验建立的清热醒脑灵片中栀子苷的HPLC含量测定方法，经方法学验证结果表明，本法专属性好，灵敏度高，稳定性及重复性均符合含量测定要求，且操作简便，可以作为清热醒脑灵片的一个质量控制方法。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准[S].中药成方制剂:第8册,1993:175.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005:173.

[3]刘宁.HPLC法测定解郁安神片中栀子苷的含量[J].中国药品标准,2008,9(6):467-469.

[4]邵燕虹,宋丽莉,周燕双.HPLC法测定清热暗疮丸中栀子苷的含量[J].医学综述,2008,14(22):3518-3519.

[5]张大军,王兆华.高效液相色谱法测定复肾宁片中栀子苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(12):88-89.

[6]黄晓丹,傅英,陈禧翎,等.HPLC法测定清开灵胶囊中栀子苷的含量[J].中国中医药信息杂志,2009,16(6):52-53.