何道辉，赵杰才

广东省东莞市大朗医院骨科，广东东莞 523770

骨肉瘤（osteosarcom）是最常见的原发性骨恶性肿瘤，血运丰富，发展迅速，可早期通过血行转移，尤其是肺转移，给治疗带来极大困难。研究表明，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）在骨肉瘤中高表达，小窝蛋白-1（caveolin-1）高度表达在低转移性骨肉瘤细胞中。但是，caveolin-1在VEGF调控的肿瘤血管生成中的具体作用及机制尚待深入研究。本实验以骨肉瘤细胞株（SOSP-9607）为细胞模型，研究caveolin-1对VEGF孵育的SOSP-9607细胞株的VEGFR-2在信使核糖核酸（mRNA）及蛋白水平表达的影响，为临床选择合适的靶点治疗骨肉瘤的血管生成提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SOSP-9607细胞株购自中山大学实验动物中心；Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI 1640）培养基购于 Gibco-BRL公司，按说明书配制，4℃保存；特级胎牛血清购于以色列Kibbutz Beit Haemek公司，分装，-20℃保存；反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒购于Fermentas公司，引物由广州瑞真生物技术有限公司合成；caveolin-1小片段干扰核糖核酸（siRNA）由广州复能基因公司合成、筛选；caveolin-1、VEGFR-2（兔抗人）一抗购于美国Sigma公司，二抗（山羊抗兔）购于广州美津生物公司。其余试剂由本实验室自行配制。

1.2 细胞培养及分组

SOSP-9607细胞按106个/ml接种于25 cm2塑料培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。每3～4天换液一次。当细胞扩增铺满80%时，以5×105个/ml的密度进行传代培养。使用广州复能基因公司构建的caveolin-1 siRNA慢病毒载体及相应包装质粒转染293T细胞产毒，收集并浓缩病毒液，-80℃保存备用。使用病毒液感染SOSP-9607细胞，获得caveolin-1表达抑制型细胞。分别对caveolin-1表达抑制型细胞和正常SOSP-9607细胞使用含有25 ng/ml VEGF的RPMI 1640培养基孵育30 min，获得VEGF+caveolin-1 siRNA组和VEGF组细胞。

1.3 逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）

按Trizol试剂说明书提取细胞RNA。按照逆转录试剂盒的说明进行操作得到cDNA。设计引物序列见表1，由广州瑞真生物技术有限公司合成。PCR反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性 60 s，60℃退火 60 s，72℃延伸 60 s；34 个循环后72℃延伸10 min。取PCR产物，应用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成相系统扫面并进行灰度分析。

表1 反转录聚合酶链式反应引物设计和产物长度

1.4 Western Blotting检测caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表达

在培养皿中加入裂解缓冲液含有50 mM Tris·Cl（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.02%NaN3、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、100 μg/ml苯甲基磺酰氟（PMSF）、1μg/mlAprotinin、1%Triton100，冰浴20 min，用细胞刮刮下细胞裂解物，4℃12000 r/min离心10 min，上清液为裂解后产生的蛋白。加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5 min，12000 r/min离心2 min，取上清液进行聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳。依次经电泳、电转、洗膜、封闭、一抗（1∶1000）37℃孵育、洗膜、二抗（1∶1000）37℃孵育、洗膜、显影、定影、扫描及灰度分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，各组样本均数间的比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOSP-9607细胞中 caveolin-1、VEGFR-2 mRNA水平的表达

RT-PCR检测 caveolin-1、VEGFR-2 mRNA水平的表达，结果显示：与对照组相比，VEGF组细胞caveolin-1 mRNA表达增加（P＜0.01），VEGFR-2 mRNA 表达明显增加（P＜0.01）；与对照组相比，VEGF+caveolin-1 siRNA组细胞caveolin-1 mRNA 表达减少，而 VEGFR-2 mRNA 表达增加（P＜0.05），与VEGF 组差异不大（P＞0.05）。 见图 1、2（图 1为反转录聚合酶链式反应扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图2为各实验组VEGFR或caveolin-1信使核糖核酸表达水平与β-actin表达水平的相对值）。

图1 反转录聚合酶链式反应检测小窝蛋白-1、血管内皮生长因子受体-2信使核糖核酸

图2 小窝蛋白-1、血管内皮生长因子受体-2信使核糖核酸表达水平

2.2 SOSP-9607细胞中caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表达

与对照组比较，VEGF组细胞caveolin-1、VEGFR-2蛋白表达均明显增加（P＜0.01），VEGF+caveolin-1 siRNA 组细胞caveolin-1蛋白表达减少，且VEGFR-2蛋白水平表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、4（图3为聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图4为各实验组VEGFR或caveolin-1蛋白质表达水平与β-actin表达水平的相对值）。

3 讨论

骨肉瘤常见于20～30岁年轻人，是最常见的原发性骨恶性肿瘤。肿瘤的血管生成对肿瘤的生长和增殖是必不可少的，同时对肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用。因此，研究肿瘤血管生成并阻断它已成为世界上治疗肿瘤的新热点[1]。大量实验结果证明，VEGF在肿瘤血管生成中处于核心地位，是目前已知活性最强、专属性最高的肿瘤血管生长诱导剂，其他血管生成因子的作用大多通过增强VEGF的表达而间接实现的。Fontanini等[2]发现，大量的新生血管可促进骨肉瘤癌前病变的进一步发展，侵袭性增强。而且，VEGF的受体VEGFR-1、VEGFR-2也在骨肉瘤中高表达，与骨肉瘤患者的临床特征和预后关系密切[3-4]。尽管如此，但在VEGF刺激下的肿瘤细胞和血管内皮细胞中由VEGFR介导血管生成的分子机制仍然知之甚少。

caveolin-1是caveolae（小窝）的重要结构蛋白，参与了caveolae的形成以及细胞增殖、分化、凋亡和血管生成的信号通路的调控，与肿瘤的发生、发展和转移有密切关系。Yang等[5]研究了大鼠原发性前列腺癌及转移性前列腺癌的多个癌细胞株，发现在大鼠正常前列腺上皮细胞中caveolin-1表达微弱；在原发性前列腺癌细胞中其表达加强、呈胞浆弥漫性；在转移性前列腺癌细胞中，其表达更强，呈浓集颗粒状。同样，在正常人前列腺上皮细胞中caveolin-1表达亦呈阴性，而在原发性前列腺癌细胞中偶见颗粒状浓集表达。其他如肾癌、膀胱癌中caveolin-1也表达增高，提示caveolin-1增高与肿瘤发生、发展有关[6]。Horiguchi等[7]发现在肾透明细胞癌中，caveolin-1表达明显增加，特别是转移性肿瘤、低分化肿瘤和有血管侵袭的肿瘤。Joo等[8]也在肾透明细胞癌中发现caveolin-1可以促进肿瘤微血管生成。

本研究中RT-PCR和Western Blot结果均发现siRNA沉默骨肉瘤细胞株SOSP-9607中的caveolin-1表达可以降低VEGF对VEGFR-2的刺激作用，并对VEGFR-2mRNA的表达影响不大，而对其蛋白水平的表达有影响，提示caveolin-1在VEGF刺激骨肉瘤细胞株SOSP-9607 VEGFR-2表达的信号中可能起着关键作用，并有可能是通过蛋白水平的调控发挥作用。

综上所述，骨肉瘤的生长和转移均是血管生成依赖性的，抑制骨肉瘤的血管生成从而阻断骨肉瘤的营养供给和转移途径可望成为治疗骨肉瘤的新策略。本实验为临床选择合适的靶点治疗抑制骨肉瘤的血管生成提供实验依据。

[1]吴朝阳,林建华.抑制血管生成治疗骨肉瘤的研究进展[J].中国骨肿瘤骨病,2007,12(6):370-376.

[2]Fontanini G,Vignati S,Bigini D,et al.Neoangiogenesis:a putative marker of malignancy in non-small-celllungcancer(NSCLC)development[J].Int J Cancer,1996,67(5):615-619.

[3]李永昊,肖玉周,汪万英.VEGF及KDR在骨肉瘤中的表达及其临床意义[J].解剖与临床,2008,13(1):27-31.

[4]沙丹,何友兼.VEGF及其受体Flt-1、KDR在鼻咽癌组织中的表达及意义[J].癌症,2006,25(2):229-234.

[5]Yang G,Timme TL,Frolov A,et al.Combined C-Myc and caveolin-1 expression in human prostate carcinoma predicts prostate carcinoma progression[J].J Cancer,2005,103(6):1186-1194.

[6]Salahaldin A,Timothy C.Caveolin-1 regulates VEGF-stimulated angiogenic activities in prostate cancer and endothelial cells[J].Cancer Biol Ther,2009,8(23):2286-2296.

[7]Horiguchi A,Asano T,Asakuma J,et al.Impact of caveolin-1 expression on clinical pathological paramet ers in renal cell carcinoma[J].J Urol,2004,172(2):718-722.

[8]Joo HJ,Oh DK,Kim YS,et al.Increased expression of caveolin-1 and microvessel density correlates with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J].BJU Int,2004,93(3):291-296.