邵志凌，何学心，向谨逸

(1.武汉铁路局社会保险管理处，武汉 430071;2.华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030;3.华中科技大学同济医学院分子生物学系，武汉 430030)

心肌纤维化指心肌间质胶原纤维过量积聚或成分发生改变［1］，是导致心功能不全、心律失常及慢性心力衰竭难以逆转的最主要病理损伤之一［2］。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌间质主要构成细胞，其增殖、表型转换为肌成纤维细胞并合成分泌大量胶原纤维蛋白。尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)最早是1985年自硬骨鱼的脊髓尾部神经分泌系统分离出来的一种生长抑素样环肽，属于神经肽范围［3］。目前研究已证实，UⅡ能促进CFs增殖［4］，但笔者尚未见UⅡ对其表型转换作用的报道。笔者在本研究以培养的新生乳鼠心肌成纤维细胞为实验模型，观察不同浓度UⅡ对I型胶原蛋白分泌及其表型转换的标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达的影响，并研究其对细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化的作用，旨在进一步探讨UⅡ诱导心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 1 d龄新生SD乳鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号:Scxk(鄂)2004-0007。UⅡ、抑肽酶(aprotinin)和亮肽酶素(leupeptin)均为Sigma公司产品、达尔伯克必需基本培养基(Dulbecco＇s minimum essential medium，DMEM)培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)，小鼠抗大鼠p-ERK1/2单克隆抗体(Santa Cruz公司)。I型胶原(Col I)ELISA试剂盒(上海森雄)。其余试剂为国产分析纯。垂直电泳仪及转膜系统(Biorad公司)，细胞显像系统(德国LEICA DC200)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和试验分组 取1d龄的SD乳鼠，在无菌条件下开胸剪取心室肌，剪碎心肌，0.1%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞密度为105个·mL-1，采用差速贴壁1 h，获得成纤维细胞。继续培养细胞至近融合状态时按1∶2传代。传代后成纤维细胞纯度达到95%。实验用第2或第3代的细胞。按照处理因素不同，分为4组，对照组，给予0.9%氯化钠溶液，UⅡ低、中、高剂量组分别给予 10-10，10-9，10-8mol·L-1UⅡ。

1.2.2 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原含量 CFs均匀接种到100mL培养瓶中，放置在37℃、5%二氧化碳(CO2)及饱和湿度条件下培养箱中进行培养。待细胞将近长满培养瓶底时，吸出培养液，对照组换用无血清培养液。继续培养48 h后收集上清液，ELISA法检测各组I型胶原含量。

1.2.3 免疫荧光 成纤维细胞用3.7%多聚甲醛固定。以0.3%的Triton X-100破膜后与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的 α-SMA 抗体孵育。荧光显微镜下观察免疫荧光标记的成纤维细胞α-SMA表达。

1.2.4 免疫印迹法检测 ERK磷酸化和 α-SMA表达 常规裂解细胞提取总蛋白，检测 p-ERK1/2和 α-SMA表达。取蛋白50 μg加入上样缓冲液煮沸3 min变性，经SDS-PAGE凝胶电泳，再电转移至聚二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，封闭后与 1∶1 000稀释的一抗4℃孵育过夜，与1∶20 000稀释的二抗室温孵育l h，再与ECL温浴l min后曝光、显影和定影，最后对结果进行吸光度扫描分析。

2 结果

2.1 UⅡ对心肌成纤维细胞上清液Ⅰ型胶原含量的影响 心肌成纤维细胞经不同浓度UⅡ刺激24 h后，ELISA结果显示随UⅡ浓度升高，各组I型胶原合成量升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，见图1。

2.2 UⅡ对心肌成纤维细胞α-SMA表达的影响 用刺激因素处理24 h后，免疫荧光法测定心肌细胞α-SMA表达见图2。经不同浓度UⅡ作用后，细胞质内α-SMA明显浓集增粗。进一步以免疫印迹法测定α-SMA表达，见图3，结果亦提示UⅡ能明显提高α-SMA表达，且各浓度组和对照组比较均差异有统计学意义(P＜0.05 或 P＜0.01)。

图1 4组心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原分泌结果A.对照组;B.UⅡ低剂量组;C.UⅡ中剂量组;D.UⅡ高剂量组;与对照组比较，*1P＜0.05，*2P＜0.01Fig.1 Effects of U Ⅱ on the type I collagen of 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of U Ⅱ group;D.high dose of UⅡ group;Compared with the control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

图2 4组心肌成纤维细胞α-SMA表达的免疫荧光图A.对照组;B.UⅡ低剂量组;C.UⅡ中剂量组;D.UⅡ高剂量组Fig.2 EffectsofU IIon α-SMA expressionby immunocytochemistry in 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of UⅡ group;D.high dose of UⅡ group

2.3 UⅡ对心肌成纤维细胞ERK磷酸化的影响 为进一步探讨UⅡ诱导心肌成纤维细胞表型转换的机制，用免疫印迹法检测各组p-ERK1/2表达，结果显示UⅡ显著提高p-ERK1/2表达，与对照组比较均差异有统计学意义(P＜0.05 或 P＜0.01)。见图4。

2.4 ERK阻断剂PD98059对UⅡ促进CFs表型转换的影响 为进一步证实ERK通路在UⅡ诱导心肌成纤维细胞表型转换中起重要作用，检测ERK阻断药PD98059(2×10-5mol·L-1)对 α-SMA 的表达，结果显示UⅡ(10-8mol·L-1)能显著提高CFs表型转换标志蛋白α-SMA的表达，以上效应能被PD98059明显减弱，统计学处理差异有统计学意义。见图5。

图4 UⅡ对ERK磷酸化的影响A.对照组;B.UⅡ低剂量组;C.UⅡ中剂量组;D.UⅡ高剂量组;与对照组比较，*1P＜0.05，*2P＜0.01Fig.4 Effects of UⅡ on ERK phosphorylation in 4 groupsA.control group;B.low dose of UⅡ group;C.medium dose of UⅡ group;D.high dose of U II group;Compared with the control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

图5 PD98059对UⅡ促进CFs表型转换的影响A.对照组;B.UⅡ组;C.UⅡ+PD98059组;D.PD98059 组;与对照组比较，*1P＜0.05，与 U Ⅱ组比较，*2P＜0.05Fig.5 Effects of PD98059 on phenotypic transition of cardiac fibroblasts enhanced by UⅡA.control group;B.U Ⅱ group;C.U Ⅱ+PD98059 group;D.PD98059 group;Compared with the control group，*1P＜0.05;Compared to the U Ⅱ group，*2P＜0.05

3 讨论

CFs是合成和分泌心脏细胞外基质的主要细胞类型，受刺激后活化，发生表型和功能的改变，成为表达α-SMA的肌成纤维细胞、过度增殖并产生大量的细胞外基质，如Col I等［1-2］。心肌组织、冠状动脉粥样硬化斑块以及脂质沉积的平滑肌细胞和巨噬细胞富含UⅡ，提示UⅡ可能影响心血管的稳态调节和病理过程［5］。此外，研究报道充血性心力衰竭、心肌肥大患者的血浆UⅡ浓度显著增高［6-8］。UⅡ还有刺激体外培养的新生鼠心肌纤维原细胞的原骨胶原αI、αⅢ和纤维原mRNA表达水平上升［9］。但目前尚无UⅡ对心肌成纤维细胞表型转换的影响的相关报道。

本研究利用体外培养的新生乳鼠心肌成纤维细胞，结果显示，各浓度UⅡ作用后，心肌成纤维细胞上清液中Ⅰ型胶原含量显著提高、胞内α-SMA表达明显增高浓集。以上结果提示UⅡ能促进心肌成纤维细胞表型转换。进一步研究UⅡ能促进心肌成纤维细胞表型转换的机制。本实验发现UⅡ能够明显上调ERK活性。ERK是丝裂原活化的蛋白激酶MAPKs之一。ERK途径是细胞生长、分化与存活等过程的重要信号转导机制。ERK通过磷酸化下游效应分子使它们活化，继而激活作用于下游的转录因子，调节相关基因转录，从而导致心肌成纤维细胞表型转换［10-12］。而给予PD98059后，α-SMA表达明显下调，进一步确定ERK通路在UⅡ诱导心肌成纤维细胞表型转换中起重要作用

综上所述，UⅡ可以明显地促进CFs表型转换为肌成纤维细胞，并分泌大量I型胶原。ERK途径在其机制占有重要地位。后续研究将着重于UⅡ对ERK下游信号分子的影响。

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