韩冰冰 王世军 赵海军 山东中医药大学基础医学院(济南 250355)

建立规范的动物模型评价体系是中医证候动物模型研究的重要环节。寒证是基本的中医证候类型,作为中医证候研究的重要切入点,具有寒证共性的中医证候模型的创建与评价一直受到关注。本实验采用中药复方复制动物模型,采用 PLS法对模型表征进行评价分析,以期建立符合中医理论的动物模型及评价体系。

1 材料与方法 1.1 实验动物 SPF级 Wistar大鼠,30只 ,体重 200±20g,雌雄各半 ,由山东鲁抗医药集团提供 ,动物生产许可证号:SCXK(鲁)20080002。

1.2 实验仪器 M C-142L型电子体温计,欧姆龙大连有限公司;DT-880B型手持式红外人体表面温度快速筛检仪,深圳市华盛昌机械实业有限公司;H-ZYC-1型四通道自主活动仪,淮北正华生物仪器公司;XRY-1A型数显氧弹热量计,上海昌吉地质仪器有限公司。

1.3 药物及试剂 生石膏产于湖北应城,知母产于河北易县,黄柏产于四川荥经,龙胆草产于吉林临江,均经山东中医药大学李峰教授鉴定。苯甲酸(国家标准物质),中国计量科学研究院 ,批号:200903。

1.4 造模方法与分组 实验动物随机分为空白对照组(10只)、虚寒组 (20只 )。虚寒组用生石膏、龙胆草、黄柏和知母,按照 2∶1.2∶1∶ 1.5比例,制成 4g/mL水煎剂,灌胃 1.6mL/100g,每天 1次 ,连续 14d。

1.5 指标检测 1.5.1 一般状况:仔细观察各组动物的活动状态、毛发洁净度、毛发疏密度、毛发光泽、爪色、耳色、舌色等情况,计入一般状况表。

1.5.2 肛温:晚 18时开始测量:将涂有凡士林的测温探头插入直肠约 3cm,测温计显示数字稳定蜂鸣音提示后读取数字。

1.5.3 趾温:使用红外体温仪检测大鼠趾温。

1.5.4 寒热趋向:使用自制寒热趋向行为测定仪检测大鼠寒热趋向。事先预热预冷,将寒、热箱温度分别控制在低于室温 3℃和高于室温 3℃(室温 24℃左右)。测试时 ,将大鼠置于大鼠常温箱 3次,记录大鼠进寒热箱的次数。

1.5.5 自主活动:采用开场实验法,使用自主活动仪记录各组大鼠 5min自主活动次数。

1.5.6 摄食量、饮水量、粪便、尿液:上午 8点将大鼠放入代谢笼,观察并记录其 24h摄食量、饮水量、尿液 (量、色、质)、粪便 (量、色、质 )。

1.5.7 单位体重摄入能、粪便能、消化能、可代谢能:将大鼠放入代谢笼,每笼 1只,观察并收集其 24h粪便,置 65℃电热鼓风干燥箱干燥至恒重,称重(精确至 0.001g)。使用 XRY-1A数显氧弹热量计检测饲料及实验动物的粪便热值。分别计算其摄入能、粪便能、消化能、可代谢能等能量代谢指标(随尿损失的能量按消化能的 2%计算)。具体公式如下:

摄入能(kJ/d)=摄入干物质量(g/d)×食物热值 (kJ/g);

粪便能(kJ/d)=粪便干重(g/d)×粪便热值 (kJ/g);

消化能(kJ/d)=摄入能(kJ/d)-粪便能(kJ/d);

可代谢能 (kJ/d)=消化能(kJ/d)-尿(kJ/d)=消化能(kJ/d)×98%

以上指标分别除以体重即单位体重摄入能、粪便能、消化能、可代谢能。

1.6 统计学方法 采用 Tanagra1.4进行偏最小二乘回归(PLS)数据分析。

2 结 果 2.1 实验数据处理 实验数据进行标准化处理,自变量表见表 1。

表1 虚寒证模型指标变量标识表

2.2 虚寒证 PLS回归模型 建立虚寒证 PLS回归模型,表达式如下:

y=3.178514+ 0.055077X1-0.003064X2+0.000141X3-0.050202X4-0.09268X5-0.000358X6-0.023644X7+ 0.020232X8+0.140244X9+ 0.038486X10+ 0.053456X11-0.091105X12+ 0.133617X13+ 0.005275X14+ 0.002452X15-0.010199X16+ 0.08835X17+ 0.003022X18-0.048857X19+0.119771X20

与虚寒证模型呈 正相关的变量有:X1、X3、X8、X9、X10、X11、X13、X14、X15、X20,与虚寒证模型呈负相关的变量有:X2、X4、X5、X6、X7、X12、X16、X17、X18、X19。

2.3 VIP变量投影重要性指标 变量投影重要性指标用来描述自变量对因变量的解释能力 ,VIP值越大,自变量 x对 y的解释能力越强,见图 1。

图1 虚寒证模型的V IP直方图

如图所示,对虚寒模型与空白比模型有重要贡献(解释能力 )的指标有:X20(1.9258)、X9(1.6881)、X17(1.5394)、X2(1.3964)、X5(1.3576)、X6(1.2253)、X14(1.1664)、X18(1.0635),VIP值均大于 1。

2.4 模型散点分布图 见图 2。

图2 虚寒证模型散点分布图

如图所示,虚寒组和空白对照组样本点完全分离,两组组之间未见任何交叉与重叠,得到了明显区分,证明造模成功。模型评价回代判别正确率 100%,用留-法交叉验证判别正确率80.77%。

2.5 模型得分见表 2。

表2 虚寒证大鼠模型评价分值

3 讨 论 自 1978年起北京医科大学梁月华等根据中医理论“寒凉药易伤阳气,阳虚则寒”开始探索给大鼠长期大量服用寒凉药复制虚寒证动物模型[1]。在此基础上,梁氏进行了大量基础研究[2,3],对虚寒证大鼠的神经、内分泌、免疫等多系统多项指标进行检测,结果证明寒凉药使交感神经一肾上腺(皮质、髓质)系统机能活动减弱,代谢降低,此结果与临床所观察的寒证、热证患者的表现一致。另外,梁氏还采用药物反证,发现温补方药对虚寒证大鼠神经内分泌方面也均有调整作用[4]。在梁氏基础上,陈小野等又进行了深入的探索。陈氏认为[5],梁氏的虚寒证和虚热证动物模型在寒证和热证上基本得到公认,但存在两个环节的不足:一是可能未能在寒、热证的基础上达到寒邪伤阳而致虚,热邪伤阴而致虚;二是在虚证上未达到“精气夺则虚”。陈氏认为,如造模时间或造模强度不足,虚证阶段仍有可能不能达到。因此尝试通过加大造模量改进这一模型并进行了大量指标的检测[6],证实该模型有程度较深的证候表现,并出现虚证,同时指出生物学特性的相关性同样为机体的重要生理病理特征,应引起重视。

本实验造模方药选自陈氏复方,用生石膏、龙胆草、黄柏和知母,按照 2:1.2:1:1.5比例,制成 4g/mL水煎剂,灌胃 4mL/d。造模药量比梁氏用量大幅度增加,预实验用药两周左右时发现动物开始出现少量死亡,并随时间延长死亡数量逐渐上升,提示耐受达到极限,因此确定造模时间为 14d。

模型复制结束后,进行模型表征的检测,并采用 PLS数据分析进行模型评价,PLS是一种新兴的统计方法,它集多元线性回归、典型相关分析和主成分分析的基本功能为一体,将建模预测类型的数据分析方法与非模型式的数据认识方法有机地结合起来,因此,偏最小二乘回归较传统的回归分析、主成分分析具有更大优势,能较好地处理基于传统最小二乘回归方法难以解决的问题,在处理样本容量小、自变量多、变量间存在严重多重相关性问题方面具有独特的优势,从而使模型精度、稳健性、实用性得到提高。

PLS模型显示虚寒组和空白对照组样本点完全分离,得到明显区分,对虚寒模型有重要贡献 (解释能力)的指标有:粪质地、毛发洁净度、尿色、体重、平均趾温、自主活动、饮水量、尿质地。其中粪质地、毛发洁净度、饮水量与模型呈正相关,体重、尿色、尿质地、平均趾温、自主活动与模型呈负相关。 PLS数据分析证实大便溏稀,毛发污秽,饮水量多,体重减轻,趾端温度低,活动量少为虚寒证模型动物的主要症状及体征。这与虚寒证的临床诊断基本相符,体现了虚寒证“阳虚内寒”的病理特点。本实验采用 PLS法建立了虚寒证模型的表征评价体系,这对于丰富与完善虚寒证动物模型的评价标准,推动中医证候动物模型的规范化进程,具有积极的科学意义和广阔的应用前景。

[1]梁月华,王 晶,谢竹藩.寒凉药与温热药对交感神经肾上腺及代谢机能的影响[J].北京大学学报(医学版),1987,19(1):54-57.

[2]杨 勇,梁月华,汪长中,等.虚寒、虚热证大鼠神经、内分泌、免疫与血液流变学的时相性研究[J].中国中医基础医学杂志,2002,8(2):109-112.

[3]李 良,刘国贞,梁月华.虚寒证鼠服温热药后脑、垂体和肾上腺内 5-羟色胺及去甲肾上腺素神经元和神经纤维的变化[J].中医杂志,2000,41(10):623-626.

[4]宋 辉,梁月华.温阳和补气药对虚寒证大鼠神经内分泌的影响[J].中国中药杂志,1997,22(3):182-186.

[5]陈小野,周永生,樊雅莉,等.大鼠虚寒证模型的研制[J].中国实验动物学报,2001,9(3):155-158.

[6]樊雅莉,张宇鹏,蒋小丽,等.大鼠虚寒证模型部分指标相关性的初步研究[J].实验动物科学与管理,2003,20(1):4-7.