刘永惠 郭少贤 常 靖 李 安 夏欣欣 王 瑞 华 莎

西安交通大学医学院第一附属医院(西安 710061)

乳腺癌的发生、发展、转移与突变型 P53基因和 mdm2基因关系密切,突变型 P53基因和 mdm2基因是肿瘤的相关基因。现代中医研究认为,肿瘤及其转移存在血瘀证,血瘀证与肿瘤增殖、转移存在正相关关系[1]。为深入研究血瘀证与活血化瘀药物抗癌的作用机理,本实验通过检测丹参酮干预血瘀证裸鼠 P53、mdm2的表达,探讨其抗肿瘤增殖、转移的作用机理。

1 材料与方法 1.1 实验动物与细胞系 雌性裸鼠 40只,5周龄,体重 (20± 1)g,来自上海斯莱克实验动物有限责任公司 ,许可证号码 SCXK(沪 2007-0005),实验和饲养均在 SPF条件下进行。乳腺癌细胞株 MDA-M B-231s购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 实验药物 丹参酮注射液购自西安交通大学医学院第一附属医院 (批号 90527CY)。肾上腺素购自上海禾丰制药有限公司(批号 H31021062)。

1.3 主要仪器与试剂 SCW-BCM生物超净工作台购自苏州市长春电子仪器厂,MDF-U72V超低温冰箱购自日本三洋公司,台式多功能离心机购自长沙市鑫奥仪器仪表有限公司,普通光学显微镜购自日本 Olympus公司,电热恒温水浴箱DR-HW-2购自北京西城区医疗器械厂,CO2细胞培养箱购自上海控菱科技有限公司,旋涡混合器购自上海第三分析仪器厂,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,P53 Elisa试剂盒购自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分装,MdM 2 Elisa试剂盒购自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分装。

1.4 方 法 1.4.1 细胞培养:人乳腺癌细胞系 MDAM B-231s在 10%胎牛血清的培养基中,5%CO2、37℃条件下培养,待细胞长至瓶底 80～90%,用 0.25%胰蛋白酶消化,3～5d传代一次。取对数生长期的细胞进行接种。

1.4.2 血瘀模型:将雌性裸鼠随机分 2大组,分别为血瘀组、空白组。空白组 10只,连续 7d每只裸鼠皮下注射 0.2mL生理盐水。血瘀组 30只,连续 7d每只裸鼠皮下注射 0.01%肾上腺素 0.2mL[2]。

1.4.3 测定指标与方法:血瘀组中随机选取 10只裸鼠和空白组 10只裸鼠,均采用摘除眼球取血法。由于裸鼠的血量较少且标本量不得低于 4mL,所以把同一组 2只裸鼠的血样合并为 1个样本 ,每组 5个样本 ,取血后立即用肝素抗凝,送至西安交通大学第一附属医院检验科进行测定。在血液流变仪上,切变率为 1s-1、5s-1、30s-1、200s-1测定全血黏度。

1.4.4 接种与给药:将血瘀组余下的 20只裸鼠,随机分为血瘀加瘤组和丹参酮组,每组 10只。将已培养的人乳腺癌细胞 M DA-MB-231s细胞悬液 0.2mL(1×10 7个)接种于裸鼠背部的外上方皮下。给药计量采用人与动物计量换算法确定。①血瘀加瘤组:每天生理盐水 0.2mL灌胃,连续给药 14d。②丹参酮组:丹参酮给予 2mgㄍkg灌胃,连续给药 14d。

1.4.5 蛋白酶联免疫检测 (ELISA)P53、mdm2,第 15天,每只裸鼠眼球采血 2mL,静置 20min,然后 3000转/分离心20min,仔细收集上清,贮存在-20℃冰箱中待检。实验步骤严格按试剂盒使用说明书操作 ,分别检测裸鼠血清 P53、mdm2蛋白的含量。

1.5 统计学分析 实验数据以均数±标准差表示,两组间数据的比较采用 t检验。 P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果 2.1 血液流变学 血液流变学检测结果见表1。

表1 血液流变学结果(±s)

表1 血液流变学结果(±s)

指标 空白组 血瘀组1S-1 28.43± 7.28 45.35± 10.56 5S-1 8.76± 2.31 13.54± 3.24 30S-1 3.53± 1.23 5.11± 3.36 200S-1 2.19± 1.24 3.99± 1.57

经 t检验后,认为空白组与血瘀组在 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1四个指标间差别均有统计学意义(P＜0.05),可以认为两组的全血黏度有差异。

2.2 P53、mdm2在血瘀加瘤组、丹参酮组中的表达情况

检测 P53、mdm2在血瘀加瘤组、丹参酮组中的表达情况见表2。

表2 P53和 mdm2检测结果(±s)

表2 P53和 mdm2检测结果(±s)

指标 血瘀加瘤组(ug/ml) 丹参酮组(ug/ml)P53 27.5213± 1.80803 19.0113± 1.06372 Mdm2 11.5725± 0.94633 5.6913± 1.30987

经 t检验后,认为丹参酮组与血瘀加瘤组比较差别均有统计学意义(P＜0.05),可认为两组有差异。

3 讨 论 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率较高,并出现逐年上升、发病年龄年轻化的趋势。据统计,每年新增乳腺癌的患者已超过 100万[3],近年来,在我国乳腺癌已成为妇女恶性肿瘤第一位[4]。祖国医学认为乳腺癌为“乳岩”、“乳石痈”、“妒乳”。血脉瘀阻是其发病的主要机制 ,又是其形成的病理结果。临床以病理性肿块、疼痛、舌质青紫为特点[5],正如《圣济总录》指出“瘤之为义,留滞而不去也。气血流行不失其常,则形体和平;或余赘及郁结壅塞,则乘虚投隙,瘤所以生。”研究表明肾上腺素多次小剂量皮下注射模拟长期肝气不疏,气滞不能行血,导致裸鼠全血黏度增高,血液处于黏、稠状态 ,形成血瘀证[2]当血浆黏度增高时,血流速度随之减缓,血流中的肿瘤细胞由于其体积较小,根据流体力学的原理,体积较小的肿瘤细胞就从血管轴心处向血管壁移动而易于附着血管壁不规则的地方,或附着于贴壁血栓上,或进入停滞于血管壁的湍流区内而使转移的肿瘤细胞得以着床,有利于肿瘤生长、浸润和转移。肿瘤形成后加剧了血脉瘀阻。血瘀证与肿瘤生长转移存在正相关关系。

野生型 P53基因是一个重要的抑癌基因,位于 17号染色体短臂 1区 3.1带 (17pl3.1)上,由 11个外显子、10个内含子组成,编码 393个氨基酸组成的 53KD的核内磷酸化蛋白。野生型 P53蛋白极不稳定,半衰期非常短,大约 20min左右 ,具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用。但野生型 P53基因却是人类肿瘤发生最常见的突变基因之一。近 50%的人类肿瘤发现有 P53突变,人类乳腺癌中 P53的突变率为 50%～70%。其突变方式有点突变、插入突变、缺失突变、移码突变等。突变型P53基因编码的 P53蛋白的半衰期可达数小时之久,突变体能够与野生型蛋白形成异四聚体。异四聚体的构象使它们处于显性抑制状态,即结构正常却失去野生型 P53蛋白的正常功能,失去了细胞周期监控器,引起细胞的增殖,最终会导致细胞癌变;并且可以抑制 P53的降解,导致细胞核内突变蛋白的积聚。一些分裂增殖的肿瘤细胞,可逃避免疫攻击向周边浸润,进入血液循环,并向远处转移,积聚的 P53蛋白可随肿瘤细胞的自溶或胞吐作用释放到胞外,进入血液循环。故认为 P53可以作为肿瘤的一种特异性标志物应用于疾病的早期诊断和预后评估中。

mdm2基因即小鼠双微体基因,是一种原癌基因 ,位于 12号染色体长臂 (12q13～14)上,编码 491个氨基酸组成的核内酸性蛋白质,对细胞生长具有调节作用,具有延长细胞生存期、促细胞增生的作用。近年来国内外研究发现,mdm2在体内是通过调节 P53的稳定性而影响细胞的状态,这两者之间存在着一种负反馈调节环即 mdm2-P53负反馈调节环[6],它与肿瘤发生、发展及转移有密切关系。 P53-mdm2负反馈调节环 ,在正常状态下,mdm2抑制野生型 P53激活转录作用且介导 P53降解;mdm2的表达又受野生型 P53的调节,这对于维持正常细胞的生长有重要意义,是机体维持正常生理功能所必须的调节机制[7]。可一但 P53和 mdm2出现异常表达 ,mdm2表达过强可封闭 P53介导的反式激活作用,使 P53功能丧失,细胞周期发生紊乱,致使细胞异常的增多,产生瘤体[8]。

活血化瘀药物丹参等在我们既往临床与实验研究中发现有抗肿瘤的作用[9],并对肿瘤转移微环境也有重要的改善作用[10]。本实验选取丹参的提取物丹参酮,干预乳腺癌突变型P53基因、mdm2基因的表达,经蛋白酶联免疫法检测发现丹参酮能有效的抑制突变型 P53和 mdm2的表达。这说明丹参酮可以降低血液粘度,改善微循环[11],缓解血瘀证状态,有利于机体发挥免疫监视作用,并且通过拮抗突变作用,可以降低突变型P53和 mdm2表达,从而发挥抑制肿瘤的作用。目前丹参酮能抑制肿瘤的突变型 P53基因、mdm2基因的表达文献报道较少,故本研究结论揭示血瘀证与肿瘤的突变型 P53基因、mdm2基因存在着密切关系,同时证实丹参酮在抑制肿瘤生长、转移中具有重要作用。

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[9]刘永惠,邓景元,邹 鹏.张玉五教授治疗肿瘤学术思想探讨[J].河北中医药学报,2006,21(4):31-33.

[10]郭少贤,刘永惠,常 靖.麝香酮干预血瘀证乳腺癌组织血管生成相关因子表达研究[J].河北中医药学报,2011,26(2):40-41.

[11]张国荣.活血化瘀法治疗恶性肿瘤作用机制探讨[J].山西中医,2010,26(5):61.