张苗，蒋春明，邵秋媛，孙琤，陶娜娜

(南京大学医学院附属鼓楼医院肾内科，江苏南京 210008)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是终末期肾病患者的一种有效的肾脏替代疗法。然而，腹膜纤维化被认为是长期PD治疗后超滤失败和退出PD的主要原因［1］。虽然腹膜纤维化发病的确切机制尚不清楚，但普遍认为，每天持续注入生物不相容性的(peritoneal dialysis fluid，PDF)导致了其形态学上和功能上的改变［2］。多种生长因子，如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)已被证实是参与纤维化发生机制的关键因素。TGF-β1被证明是导致纤维化的最重要的生长因子。丹参酮ⅡA是中药丹参的提取物，已被广泛应用于心脑血管疾病方面的治疗。越来越多的证据表明，丹参酮ⅡA可抑制纤维化及炎症［3］。本研究主要探讨丹参酮ⅡA对PD大鼠模型伴发腹膜纤维化的预防干预作用。

1 材料和方法

1.1 化学品和试剂

丹参酮ⅡA购自江苏Carefree集团有限公司(南京，中国)。丹参酮ⅡA的结构如图1所示。4.25%葡萄糖浓度的PDF(Dianeal-N的PD-4)由百特医疗用品有限公司(广州，中国)提供。兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体、羊抗鼠CTGF多克隆抗体、兔抗肌动蛋白抗体和增强化学发光试剂购自Santa Cruz生物技术(Santa Cruz，加利福尼亚，美国)。Pv-6001免疫组织化学试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司(北京，中国)。正常兔和羊血清购自GIBCO(Great Island，纽约，美国)。TRIzol试剂和莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶是从Invitrogen公司(Carlsbad，加利福尼亚州，美国)购买。Taq DNA聚合酶、dNTP、RNAsin、寡(dT)15 引物以及TGF-β1、CTGF 和β-actin的寡核苷酸购自TaKaRa生物工程公司(大连，中国)。重组大鼠的TGF-β1、CTGF和β-actin是从武汉EIAab科技有限公司(武汉，中国)购买。牛血清白蛋白购自Amresco公司(Solon，俄亥俄州，美国)。

图1 丹参酮ⅡA的化学结构Fig 1 Chemical structure of tanshinoneⅡA

1.2 动物

40只体重180～220 g的雄性SD大鼠，饲养于南京大学模式动物研究中心(南京，中国)，可自由获得食物和水。该动物照顾与使用委员会机构坐落在南京大学医学院附属鼓楼医院，具备所有动物的核准协议。本研究实验是遵循国家对实验动物使用机构的健康指南进行的。

1.3 实验方法和分组

将大鼠随机分为4组，每组各10只。对照组每天接受生理盐水20 ml腹腔注射;PDF组每天接受4.25%葡萄糖浓度的PDF 20 ml腹腔注射;低剂量丹参酮组(TL)及高剂量丹参酮组(TH)每天接受终浓度为50 mg·L－1及100 mg·L－1丹参酮ⅡA 的4.25%葡萄糖浓度的PDF 20 ml腹腔注射。8周后，我们在最后一次注射后4 h处死所有大鼠并从中获得壁层腹膜和网膜以供实验所用。

1.4 组织学分析

用光学显微镜观察福尔马林固定、石蜡包埋切片(2 μm)并做HE染色和Masson染色的壁层腹膜组织。壁层腹膜致密层厚度(sub-mesothelial compact zone，SCZ)测量用200倍原图放大的Image-Pro Plus 5.0图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)进行图像分析。由Honda等［4］报道的五点测量方法来计算平均SCZ厚度。

1.5 免疫组化

低温恒温器内壁层腹膜(2 μm厚)的处理采用间接免疫酶染色法。主要使用以下抗体:(1)兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体;(2)羊抗鼠CTGF多克隆抗体。TGF-β1和CTGF的免疫组化检测使用的是pv-6001免疫组化试剂盒，采用的图像分析软件为Image-Pro Plus 5.0。阴性对照是通过取代正常兔或山羊血清的主要抗体获取。

1.6 RT-PCR

根据制造商的协议用TRIzol试剂提取100 mg网膜中的总RNA。用总RNA中的1 μg于37℃、50 min在逆转录酶的作用下反转录成cDNA并进行聚合酶链反应(PCR)。PCR 引物序列如下:TGF-β1(forward:5'-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3'，reverse:5'-TGGGACTGA TCCCATTGATT-3');CTGF(forward:5'-GCTAAGACCTG TGGAATGGGC-3'，reverse:5'-CTCAAAGATGTCATTG CCCCC-3');β-actin(forward:5'-CGCCAACCGCGAGAAG AT-3'，reverse:5'-CGTCACCGGAGTCCATCA-3')。循环参数设置如下 最后的延伸在72℃进行10 min。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，TGF-β1和CTGF的含量使用Image-Pro Plus 5.0分析。β-actin作为一个正常化的内部对照。

1.7 Western blotting 分析

将冷冻的网膜匀浆和提取的蛋白质(60～100 μg)用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并电聚转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。该膜和抗TGF-β1、CTGF、β-actin 抗体共同孵育 1 h。经过 3 次Tween 20的Tris-缓冲盐溶液(TBST)水洗后，印迹用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗和增强化学发光试剂孵化、水洗和生长。重组TGF-β1和CTGF蛋白大鼠作为阳性对照，牛血清白蛋白作为阴性对照。每个蛋白条带的密度进行了量化，并与正常化的β-actin对照。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 壁层腹膜的组织学变化

用苏木精 伊红和Masson染色对壁层腹膜的形态学改变进行了评估。在8周后，PDF组的腹膜样本相较于对照组的腹膜明显增厚(图2A、B)。丹参酮ⅡA明显抑制了腹膜致密层厚度的增加(图2C、D、E)。形态学评估揭示了剂量依赖性丹参酮ⅡA对PDF引起的腹膜增厚具有显著的抑制作用。在PDF处理的大鼠腹膜可观察到Masson染色的大面积蓝色区域，却未出现在对照组(P＜0.01，图 3A、B)。与此相反，Masson染色的蓝色区域在低剂量和高剂量丹参酮ⅡA处理的大鼠细胞外基质较无处理的PDF组明显降低(P＜0.01，图3C、D、E)。高剂量的丹参酮ⅡA比低剂量的丹参酮ⅡA能更有效地降低腹膜基质积聚(P＜0.01)。

图2 壁层腹膜致密层(SCZ)的厚度(HE染色，×200，比例尺代表100 μm)Fig 2 Hematoxylin·eosin staining of sub-mesothelial compact zone in each group (×200)

2.2 免疫组化分析壁层腹膜中TGF-β1和CTGF的表达

免疫组织化学法检测TGF-β1和CTGF的表达提示在对照组中获得壁层腹膜组织的一些背景染色(图4A、5A)。与此相比，PDF组发现一个更强的阳性染色(P＜0.01，图4B、5B)。丹参酮ⅡA治疗后壁层腹膜中 TGF-β1和 CTGF 的表达显著降低且呈剂量依赖性(图4C、D、F，图5C、D、F)。

图4 壁层腹膜中TGF-β1的表达(×400)Fig 4 Expressions of TGF-β1in parietal peritoneum in each group(×400)

2.3 TGF-β1、CTGF mRNA 和蛋白质在大网膜中的表达

与对照组相比，PDF组大鼠大网膜中TGF-β1和CTGF在mRNA以及蛋白水平的表达上有显著提高(P＜0.01，图6A～D)。联合低或高剂量丹参酮ⅡA治疗后由PDF导致的TGF-β1和CTGF的mRNA和蛋白表达明显减弱(P＜0.01或0.05)，而高剂量丹参酮ⅡA治疗组表现出更强的抑制作用。

3 讨 论

腹膜纤维化是长期行PD伴发的腹膜结构性变化。纤维化程度与PD的时间相关［2］。长期以来，纤维化已是腹膜功能进行性下降和超滤失败的主要原因。传统PDF所具有的生物不相容性(如高糖、低pH、乳酸盐缓冲碱等)是腹膜纤维化发生的主要原因。其中，TGF-β1的过度表达在腹膜纤维化中起关键作用，并贯穿于纤维化发生到维持的整个过程。在PD过程中，尿毒症毒素如晚期糖基化终产物等通过人类腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)表面受体刺激TGF-β1的分泌;传统非生物相容性PDF中的高糖、低pH值及反复发生的腹腔内细菌感染引起腹膜间皮细胞、成纤维细胞及浸润的巨噬细胞分泌TGF-β1。TGF-β1的过度表达和分泌促进了细胞外基质的沉积，最终导致腹膜纤维化的发生。同样的，CTGF作为一个促纤维化因子，亦参与了腹膜纤维化发生的病理生理过程，且CTGF的表达与TGF-β1水平呈正相关关系。在我们的PD动物模型中，腹膜暴露于PDF中超过8周后，我们观察到了与长期PD患者腹膜中类似的变化，如腹膜致密层增厚与基质积聚、TGF-β1和CTGF的表达等。

现在普遍认为TGF-β1是腹膜自身产生、并且是改变腹膜功能和结构的主要生长因子。TGF-β1是由暴露在各组分的 PDF中的HPMCs诱导产生的［5］。另外，TGF-β1基因可转染诱导大鼠腹膜产生纤维化［6］。而CTGF是TGF-β1诱导的各种组织纤维化的主要下游因子。高糖和TGF-β1均能增加HPMCs中CTGF以及细胞外基质的表达［7-8］。近期 Mizutani等［9］研究表明，高腹膜转运状态与腹膜纤维化及间皮细胞中CTGF表达的增加有关。此外，研究发现CTGF的敲除可减少HPMCs培养中由TGF-β1诱导产生的基质蛋白［10］。因此，CTGF在腹膜纤维化的进展中也发挥了重要作用。我们的研究结果显示，TGF-β1在PD大鼠壁层腹膜和大网膜中表达增加，表明了TGF-β1在因PDF引起的腹膜纤维化中起着关键作用。本研究也证实，CTGF在PDF治疗组的大鼠壁层腹膜与大网膜中表达增加。从而进一步证明，我们的实验不但从组织学角度，而且从发生机制上证明PD大鼠模型发生了腹膜纤维化的改变。

图6 大网膜中TGF-β1，CTGF mRNA和蛋白质水平的表达Fig 6 The mRNA and protein expression of TGF-β1and CTGF in omentum

抑制腹膜间皮细胞损伤和腹膜致密层的增厚，促进间皮细胞增生，维持紧密连接结构完整性，拮抗PDF对腹膜组织结构和功能的损害，可预防和延缓腹膜纤维化。常规PDF中加入添加剂可提高传统PDF的生物不相容性或抑制腹膜纤维化的进程［11-12］。Mastuo等［13］观察了关于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)对由高糖诱导产生的腹膜纤维化的影响，指出HGF能够挽救被高糖所抑制的腹膜间皮细胞的生长。他们得出结论是外源性HGF能阻止腹膜纤维化的发生。对长期PD大鼠的体内实验研究结果亦表明，5'-磷酸吡哆醛同样能够显著抑制PDF引起的腹膜增厚，降低TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白在大鼠腹腔内的表达［14］。类似地，在动物模型中发现PDF中添加氨基胍类也能够阻止腹膜纤维化［15］。

近来一些研究表明，丹参酮ⅡA具有显著的抗纤维化作用［9］。例如，丹参酮ⅡA能减轻心肌纤维化及调节肾性高血压大鼠的胶原代谢［16］，还可防止肝肾纤维化［17］。本研究中，丹参酮ⅡA干预后减少了PD大鼠腹膜致密层的厚度、基质在腹膜的积聚、壁层腹膜中TGF-β1和CTGF的表达及大网膜中TGF-β1和CTGF的表达。这些结果显示丹参酮ⅡA能够通过抑制腹膜自身TGF-β1和CTGF的表达水平来防止PDF诱导的腹膜纤维化。我们的研究首次证明在传统PDF中添加丹参酮ⅡA具备预防腹膜纤维化的有效作用。联合低或高剂量丹参酮ⅡA的PDF治疗组中由PDF引起的TGF-β1和CTGF在壁层腹膜和大网膜中的表达增加得到了明显抑制，腹膜纤维化明显减轻。

丹参酮ⅡA是一种二萜，它被认为是中药丹参的一个主要生物活性分子。丹参酮ⅡA的体内和体外毒性试验已得到很好的研究［18］。从小鼠模型获得的资料显示，丹参酮ⅡA的半数致死量(LD50)为25.807 g·kg－1，相当于临床人类口服剂量的约4 000倍。此外，研究发现给大鼠口服剂量为2 500 mg·kg－1的丹参提取物(400倍的人口服剂量)90 d是无毒性的［19］。体外研究数据还表明丹参酮ⅡA不抑制大鼠心肌细胞的存活能力［20］。本研究提示，在临床上长期接受PD的患者中将丹参酮ⅡA作为添加剂防止腹膜纤维化是可能的，值得进一步探讨。

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