王 晔,刘乃红,王 锐,杨小荣,李建国,张 策

目前对缺血后脑损伤的机制尚未阐明,临床上也无理想的治疗手段[1,2]。海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感。在缺血再灌注过程发生过程中,如果缺血过程较为短暂,则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡,即凋亡[3,4]。NM DA受体过度激活或不受调控的活化已经被证实牵涉在诸如脑中风、脑创伤等许多急慢性中枢神经系统病症中,并介导了兴奋毒性神经元死亡[5-11]。NMDA受体特异性拮抗剂的使用,发挥了不同程度的缺血再灌注后保护作用蛋白激酶C,属于丝氨酸/苏氨酸激酶的家族成员,在记忆的形成、诱导LTP和突触囊泡的释放中发挥着关键性的作[12]。用[13]。NMDA受体是 PKC的潜在作用靶点,PKC可以使NR1、NR2B、NR2B等 NMDA受体亚基发生磷酸化而活化[14,15]。钙调节蛋白酶Ⅱ(Calmodulin,CaMⅡ在神经元损伤继而发生的钙离子大量内流中发挥着重要作用,其与NM DA受体亚基NR2B亚基形成的复合物在神经元损伤中发挥着重要的作用。本研究旨在研究大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区NM DA受体NR1、NR2A、NR2B亚基的磷酸化水平变化及其与神经元死亡之间的关系,探索这种表达变化可能的上游调控因子。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 雄性Wistar大鼠50只(体重180 g～250 g),由山西医科大学实验动物中心提供。采用改良Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。大鼠存活6 h、24 h或48 h后进行相关实验。

1.2 Caspase-3活性检测 用酶标法测定脑组织裂解物中Caspase-3的活性,蛋白含量标准化校正后的OD值:以正常组的活性为1,计算其余各组的相对活性。

1.3 Western-Blot检测 大鼠在短暂性全脑缺血15 min后再灌注,在缺血再灌注后不同时间点(6 h、24 h、48 h)断头取脑,分离出海马,并迅速在解剖显微镜下将海马CA1区组织分离出来。提取脑组织细胞膜蛋白样品。聚丙烯酰胺凝胶变性电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹完毕后,抗体按照1∶1 000稀释,β-actin作为内参。经KODAK IS440自显影系统进行曝光显影,使用KODAK MI软件进行吸光度值测定分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析。数据以均数±标准差(±s)表示,成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),检验水准a=0.05。

2 结 果

2.1 大鼠海马CA1区Caspase-3活性检测 与对照组相比,缺血再灌注组Caspase-3酶活性显著升高,随着再灌注时间的延长而逐渐增加,并且在缺血再灌注24h时达到高峰(P＜0.05)。详见图1。

图1 大鼠海马CA1区caspase-3酶活性变化

2.2 缺血再灌注后各蛋白磷酸化水平 N R1亚基作为NMDA受体的基本亚基,其磷酸化水平呈现逐渐升高的趋势,并且在24 h达到高峰,但在48 h时有明显下降,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05,见图2)。NR2B亚基磷酸化水平与NR1亚基的磷酸化水平变化趋势相似,在24 h达到高峰,48 h开始下降,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05,见图3);但是,NR2A亚基磷酸化水平随着缺血再灌注时间的延长呈现持续增高的趋势,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05,见图4)。

蛋白激酶C的磷酸化水平在脑缺血再灌注后呈现逐渐增高趋势,6 h即有明显增高,于24 h达到高峰,在48 h略有下降,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05,见图5)。

钙结合调节蛋白酶Ⅱ(CaMⅡ)磷酸化水平在脑缺血发生过程中呈现逐渐增高的趋势,与 NR1、NR2B、PKC磷酸化水平变化趋势相似,于24 h达到高峰,48 h略有下降,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05,见图6)。

3 讨 论

本研究表明,大鼠全脑缺血再灌注发生过程中,Caspase-3的活性随着缺血再灌注时间延长呈现逐渐升高趋势,于24 h达到高峰,并且于48 h开始下降,这与 NMDA受体、PKC和CaMII的变化具有相同变化趋势。提示其参与了脑缺血再灌注后海马CA1区神经元的损伤。Western-Blot结果提示海马CA1区组织中NMDA受体亚基NR1,NR2A,NR2B的磷酸化水平变化呈现时间依赖性改变,并且在海马CA1区锥体神经元未发生大量凋亡前就有了明显的增高。其中,NR1和NR2A于24 h达到高峰,48 h开始下降;NR2A亚基的磷酸化水平水呈现持续性升高的趋势,这可能与其他激酶,如SFKS(Src family tyrosine kinases)介导的NM DA受体磷酸化有关。机体中最大的酪氨酸激酶系统之一Eph-ephrin配体受体系统通过其中的配体EphrinB2反向信号介导了由SFKS参与的NMDA受体亚基NR2A磷酸化[16,17]。本研究中,NMDA受体中的不同亚基如NR1、NR2A和NR2B的磷酸化水平变化趋势不完全相同,因此推测在脑缺血再灌注发生后,含有NR2A或者NR2B亚基的NMDA受体通过不同功能变化,共同影响了神经元死亡。

PKC,作为G蛋白偶联受体信号转导途径中第二信使传递中的重要一环,在脑学习记忆中也具有关键性的作用[13],其参与了LTP的诱导形成以及突触囊泡的释放。PKC的激活在非洲爪蟾卵细胞上增加了NMDA受体通道的开放,以及促使NM DA受体在细胞膜上表达增多[18]。PKC在丝氨酸890、896位点磷酸化NMDA受体亚基NR1,并且促使了NMDA受体向细胞膜转运[19,20]。在本实验中,PKC的磷酸化水平与NMDA受体NR1、NR2B亚基的磷酸化水平具有时间上的相关性。表明在脑缺血再灌注发生过程中,NM DA受体亚基的磷酸化与PKC有关。CaMⅡ的激活依赖于NMDA受体的激活、胞外钙离子大量内流以及其自身的磷酸化[21]。本研究发现,在缺血再灌注发生过程中,CaMⅡ呈现出与PKC、NR2B磷酸化水平变化相同的趋势,PKC、NR2B、CaMⅡ三者参与了海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡过程。2000年Strack等[22]研究发现,插入在胞浆内部的NR2B第1290-1309位氨基酸残基是CaMⅡ的结合部位,而且由于CaMⅡ具有自身磷酸化的作用,导致了CaMⅡ与NR2B亚基具有非常高的结合能力[23]。这与本研究结果相一致。

[1]O'Collins VE,M acleod M R,Donnan GA,et al.Experimental treatments in acute stroke[J].Ann Neurol,2006,59:467-477.

[2]Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999,79:1431-1568.

[3]Jourdain P,Nikonenko I,Alberi S,et al.Remodeling of hippocampal synaptic networks by a brief anoxia-hypoglycemia[J].J Neurosci,2002,22:3108-3116.

[4]M alenka RC,Bear MF.LT P and LTD:An embarrassment of riches[J].Neuron,2004,44:5-21.

[5]Siesjo BK.Calcium and cell death[J].Magnesium,1989,8:223-237.

[6]Olney JW.Excitotoxicity,apoptosis and neuropsychiatric disorders[J].Curr Opin Pharmacol,2003,3:101-109.

[7]Lee JM,Zipfel GJ,Choi DW.T he changing landscape of ischaemic brain injury mechanisms[J].Nature,1999,399:A7-A14.

[8]Rothman SM,Olney JW.Excitotoxicity and the NMDA receptorstill lethal after eight years[J].Trends Neurosci,1995,18:57-58.

[9]Choi DW.Ex citotoxic cell death[J].J Neurobiol,1992,23:1261-1276.

[10]Choi DW.Calcium:Still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death[J].Trends Neurosci,1995,18:58-60.

[11]Choi DW,Koh JY.Zinc and brain injury[J].Annu Rev Neurosci,1998,21:347-375.

[12]Wahlestedt C,Golanov E,Yamamato S,et al.Anti-sense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitoxicity and reduce focal ischemic infarctions[J].Nature,1993,363(20):260-265.

[13]Wang H,Hu Y,T sien JZ.Molecular and sy stems mechanisms of memory consolidation and storage[J].Prog Neurobiol,2006,79:123-135.

[14]Leonard AS,Hell JW.Cy clic AM P-dependent protein kinase and protein kinase C phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites[J].Biol Chem,1997,272:12107-12115.

[15]T ingley WG,Ehlers MD,Kameyama K,et al.Characterization of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation of the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit using phosphorylation site-specific antibodies[J].Biol Chem,1997,272:5157-5166.

[16]Palmer A,Zimmer M,Erdmann KS,et al.EphrinB phosphorylation and reverse signaling:Regulation by Src kinases and PTP-BL phosphatase[J].Mol Cell,2002,9:725-737.

[17]Lu YM,Roder JC,Davidow J,et al.Src activation in the induction of long-term potentiation in CA1 hippocampal neurons[J].Science,1998,279:1363-1367.

[18]Lan JY,Skeberdis VA,Jover T,et al.Protein kinase C modulates NMDA receptor trafficking and gating[J].Nat Neurosci,2001,4:382-390.

[19]Scott DB,Blanpied TA,Swanson G T,et al.An NMDA receptor ER retention signal regulated by phosphory lation and alternative splicing[J].J Neurosci,2001,21:3063-3072.

[20]Scott DB,Blanpied T A,Ehlers MD.Coordinated PKA and PKC phosphorylation suppresses RXR-mediated ER retention and regulates the surface delivery of NMDA receptors[J].Neuropharmacology,2003,45:755-767.

[21]袁维秀,杨红.N-甲基-D天冬氨酸2B受体功能的研究进展[M].国外医学:医药学分册,2004,31(3):146-149.

[22]Strack S,McNeill RB,Colbran RJ.Mechanism and regulation of calcium calmodulin-dependent protein kinaseⅡtargeting to the NR2B subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor[J].J Biol Chem,2000,275(3):23798-23806.

[23]Strack S,Colbran RJ.Auto-phosphorylation dependent targeting of calcium calmodulin dependent protein kinaseⅡby the NR2B subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor[J].J Biol Chem,1998,273(3):20689-20692.