季仁升，孙黔云，乙 引

(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001;2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002)

蛇毒中含有大量以蛋白质为主的生物活性物质，主要影响机体的血液循环系统、神经系统和肌肉组织等，开展蛇毒研究对蛇伤防治、相关生命科学研究、新药研发具有重要的意义和价值［1］。原矛头蝮蛇(Protobothrops mucrosquamatus)，又称烙铁头蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)，属蝰蛇科原矛头蝮属，主要分布在我国的南方地区和台湾地区，是一种常见剧毒蛇，属血循毒。其蛇伤临床表现主要为出血、肿胀、严重时流血不止。迄今为止，已经从原矛头蝮蛇毒中分离纯化出数个蛋白，涉及L-氨基酸氧化酶、磷脂酶 A2、凝集素、纤溶酶等［2－4］，但总体上对其研究较少。本文报道了湖南产原矛头蝮蛇毒中一个新颖丝氨酸蛋白酶的分离纯化与相关性质研究。

1 材料与方法

1.1材料原矛头蝮蛇毒采集于湖南省武陵山区;蛋白分离介质 DEAE Sephadex A-50凝胶、Sephadex G-75凝胶、Sephacrycl S-100凝胶、Heparin HP凝胶、Hitrap Q HP预装柱、低分子量蛋白质标准Marker、凝胶过滤测定分子量试剂盒、两性电解质Ampholine(pH 3.5～10)均购自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素)、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA)、牛纤维蛋白原、苯甲酰-L-精氨酸乙酯(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride，BAEE)、偶氮酪蛋白(azocasein)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自美国Sigma公司;增强型BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所;绵羊红细胞采自贵阳医学院实验动物中心，混合人血清由本实验室健康志愿者献血制备而得;昆明种小鼠购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，合格证号:SCXK(渝)2007-0005;其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2仪器AKTA Prime蛋白层析系统、Gene Quant紫外分光光度计(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Spectra MAX-190连续波长酶标仪(美国MD公司);5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);FDU-1100冷冻干燥机 (日本东京理化器械株式会社);DYY-8C电泳仪、DYCZ-24D电泳槽(北京市六一仪器厂)。

1.3方法

1.3.1目标蛋白的分离纯化1.0 g原矛头蝮蛇粗毒冻干粉溶于7 ml的50 mmol·L－1pH 8.9 Tris-HCl缓冲液中，离心后取上清上样于DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱(2.6 cm×90 cm)，充分洗脱后用0 ～0.4 mol·L－1NaCl(1 000 ml∶1 000 ml)线性洗脱，流速为 24 ml·h－1，每管收集 6 ml，检测纤维蛋白原水解活性，收集相关活性峰，冻干后溶于PBS缓冲液，上样于Sephadex G-75凝胶(1.6 cm×75 cm)，流速为 15 ml·h－1，每管 3 ml，收集活性峰浓缩，脱盐，上样于肝素亲和柱(1.0 cm×15 cm)，在AKTA Primer上进行分离纯化，流速为2 ml·min－1，收集活性峰，再采用 HiTrap Q HP 1 ml预装柱分离纯化，流速为1 ml·min－1，收集活性峰，12%SDS-PAGE测定纯度。

1.3.2分子量和等电点的测定12%SDS-PAGE测定目标蛋白在还原与非还原条件下的分子量。凝胶过滤测定分子量采用Sephacrycl S-100凝胶(1.0 cm×60 cm)，按照试剂盒说明书进行。变性条件下目标蛋白的等电点测定同文献［5］。

1.3.3蛋白水解活性检测

1.3.3.1纤维蛋白原水解活性测定 参照文献［5］的方法加以改动。200 μl质量分数为0.2% 纤维蛋白原液(400 μg，50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mol·L－1NaCl配制)加入 100 μl PMSP-A(含20 μg)于 37℃水浴孵育 1/6、1/2、1、2、3、6、9、12 和24 h后，12%SDS-PAGE检测。

1.3.3.2纤维蛋白水解活性测定 参照文献［5］的方法加以改动，取90 mm直径平皿加入9 ml质量分数为0.5%牛纤维蛋白原，再加入300 μl 20 kU·g－1的人凝血酶，混匀后室温放置2 h，然后加入20 μl PMSP-A(含20 μg)，37℃孵育 24 h 后，观察测量水解圈。原矛头蝮蛇粗毒为阳性对照。

1.3.3.3精氨酸酯酶活性测定 参考文献［5］的方法:BAEE 作为底物，100 μl PMSP-A(含 100 μg)加入 3 ml BAEE(1 mol·L－1，67 mmol·L－1，pH 7.0的PB配制)，于37℃水浴孵育6 h后，253 nm测定吸光度，将每分钟吸光度上升0.001定义为1个活力单位，原矛头蝮蛇蛇粗毒为阳性对照。

1.3.3.4偶氮酪蛋白水解活性 测定参照文献［5］的方法:100 μl PMSP-A(含100 μg)加入1 ml azocasein(5 g·L－1，60 mmol·L－1NaHCO3配制)于37℃水浴孵育6 h后，加入1 ml 1.16 mol·L－1高氯酸终止反应，溶液过滤后于390 nm测定吸光度。原矛头蝮蛇粗毒为对照。

1.3.4酶抑制剂对纤维蛋白原水解活性的影响测定参照文献［5］的方法:100 μl PMSP-A(含 4 μg)分别与 PMSF(10 mmol·L－1)、EDTA(10 mmol·L－1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L－1)、SBTI(0.5 g·L－1)、EGTA(50 mmol·L－1)在 37 ℃孵育30 min后加入20 μl(含40 μg)牛纤维蛋白原孵育24 h，10%SDS-PAGE检测纤维蛋白原水解活性。

1.3.5抗补体活性测定抗补体活性经典途径测定参考文献［6］方法。样品、人血清(1∶17.5稀释)各100 μl混匀，37℃水浴预孵30 min或不预孵，然后加入100 μl致敏绵羊红细胞(5 ×1011cells·L－1)混匀，37℃孵育30 min后再加入1 ml冷生理盐水终止反应，2 000 r·min－1离心10 min，取上清液于412 nm测定吸光度。

1.3.6出血毒活性检测参照文献［7］的方法加以改动。♀昆明种小鼠(体质量20～30 g，n=6)背部皮下注射 2.5 μg·g－1PMSP-A，24 h 后皮肤内侧检测出血情况，原矛头蝮蛇粗毒为阳性对照。

1.3.7水肿活性检测参照文献［8］的方法加以改动。昆明种小鼠(体质量20～30 g，n=6)随机分组，每组♀♂各半，左、右后足分别注射15 μl PMSPA(含5 μg)与PBS缓冲液，2.5 h后处死，在相同位置剪下左、右后足，称重后计算肿胀率:

1.3.8流血时间测定参照文献［4］的方法加以改动，昆明种小鼠(体质量20～30 g，n=6)随机分组，每组♀♂各半，以0.5 μg·g－1的剂量尾部静脉注射目标蛋白，正常对照组注射同等体积的PBS缓冲液，注射30 min后，距尾部末端1.0 cm处切深度1～2 mm的伤口，血液自行流出开始计时，每30 s用滤纸吸去血滴，直至流血停止(以滤纸吸取时无血流出作为流血停止标志)。

1.3.9肽指纹图谱测定纯化后的样品经还原SDS-PAGE电泳后，切取含有蛋白的胶条用胰蛋白酶水解，用4700 proteomics Analyzer(Applied Biosystems，USA)进行肽指纹图谱测定。激光源为355 nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。PMF质量扫描范围为700～4 000 u，且强度最大的10个峰进行串级质谱分析;谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。所得结果用GPS(Applied Biosystems，USA)–MASCOT(Matrix Science，London，UK)进行数据库检索。搜索参数设置:数据库为NCBInr;数据检索的方式为combined;最大允许漏切位点为1;质量误差范围设置:PMF±100 ppm，MS/MS±0.6 u。

1.3.10统计学分析本实验数据采用±s表示，采用SPSS 16.0以t检验进行统计学分析。采用GraphPad Prism 3进行作图分析。

2 结果

Fig 1 Purification of PMSP-A

2.1PMSP-A的分离纯化原矛头蝮蛇毒经DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析后取第340～356管(Fig 1A)收集合并上样于Sephadex G-75凝胶层析柱，取洗脱峰2(21～36管)(Fig 1B)，再经Heparin HP亲和层析纯化，取洗脱得到第一个蛋白峰(Fig 1C)，最后经HiTrap Q HP阴离子交换层析得到的目标蛋白(Fig 1D)，命名为PMSP-A，SDS-PAGE检测为一条带。

2.2分子量与等电点经12%SDS-PAGE检测，PMSP-A在非还原条件下分子量为26.1 ku，还原状态下呈现分子量分别是15.1 ku与14.4 ku的两条多肽链(Fig 2A)。经Sephacryl S-100凝胶过滤测定，PMSP-A分子量为25.3 ku(Fig 3)。通过等电聚焦电泳测定PMSP-A的两条肽链的等电点分别为5.7与6.1(Fig 2B)。

Tab 1 Theoretical and experimental peptide masses of PMSP-A

Fig 2 Electrophoresis of PMSP-A

2.3蛋白水解活性及抑制剂对蛋白质水解酶活性的影响

2.3.1纤维蛋白原水解活性PMSP-A能够依次水解纤维蛋白原的Bβ链，Aα链，孵育24 h内没有检测到水解γ链(Fig 4)。

2.3.2抑制剂对纤维蛋白原水解活性影响PMSP-A的纤维蛋白原水解活性受PMSF、1，10-phenan-throline的抑制，EDTA、EGTA、SBTI不能抑制其水解活性(Fig 5)。

Fig 3 Molecular weight determination of PMSP-A by gel filtration on a Sephacryl S-100 column

Fig 4 Fibrinogenolytic activity of PMSP-A

Fig 5 Effect of inhibitors on the fibrinogenolytic activity of PMSP-A

2.3.3纤维蛋白水解活性PMSP-A对纤维蛋白具有水解活性(Fig 6)。

Fig 6 Fibrinolytic activity of PMSP-A

2.3.4其他蛋白水解活性测定PMSP-A的精氨酸酯酶活力单位为8.7 kU·g－1，它没有偶氮酪蛋白水解活性。

2.4肽指纹图谱分析肽指纹图谱测定PMSP-A与黄绿烙铁头蛇毒中C-型凝集素二聚体中链A的部分肽段吻合。

2.5抗补体活性预孵条件下终浓度为0.075 g·L－1的PMSP-A对补体经典途径溶血有(55.59±5.22)% 的抑制率，在不预孵条件下只有微弱的抑制活性(4.66±1.50)%。

2.6出血活性以2.5 μg·g－1剂量的 PMSP-A注射到小鼠皮下，24 h后未见出血斑点。

2.7水肿活性5 μg PMSP-A注射到小鼠足趾，2 h后引起的肿胀率为(14.55±3.13)%，见Fig 7。

Fig 7 Effect of PMSP-A on inducing edema of mice paw

2.8对流血时间的影响0.5 μg·g－1剂量的PM-SP-A注射到小鼠尾静脉，与PBS对照组(502.20±172.25)s相比，PMSP-A能够明显延长小鼠尾静脉的流血时间(803.57±224.28)s。

3 讨论

本研究从湖南产原矛头蝮蛇毒中分离纯化得到一个具有纤溶活性的酸性蛋白酶PMSP-A，其由两条非均等的肽链共价键组成，分子量(25～26)ku。它能够依次水解纤维蛋白原的Bβ、Aα链，活性能够被PMSF抑制，EDTA、EGTA不能抑制其活性，且具有精氨酸酯酶活性，提示PMSP-A为丝氨酸蛋白酶。PMSP-A对纤维蛋白也具有水解活性，同时它能抑制补体经典途径溶血，PMSP-A能明显延长小鼠尾静脉的流血时间，引起小鼠足趾水肿，无出血毒活性。

非还原SDS-PAGE和凝胶过滤检测PMSP-A为单一蛋白，还原SDS-PAGE则表现为两条非均等的多肽链，表明PMSP-A是由两条非均等肽链共价组成。这种肽链的不均等可能是由于蛋白质后期修饰造成的差异，也可能是两条不同的肽链。迄今为止，只在我国台湾地区产原矛头蝮蛇毒中发现过两个双链结构的蛋白，其中一个是具有血小板凝集活性但无纤维蛋白原水解活性的双链蛇毒蛋白［9］，另外一个是也具有血小板凝集活性的C-型凝集素［3］。因此，可以认为PMSP-A是首次从原矛头蝮蛇毒中发现的双链丝氨酸蛋白酶。

蛇毒丝氨酸蛋白酶具有纤维蛋白(原)水解活性，在血管疾病治疗方面有着广泛的价值，目前已有数种蛇毒丝氨酸蛋白酶制剂如 Ancrod、Batroxobin等在临床应用［10－11］。本工作中的 PMSP-A具有纤维蛋白(原)水解活性，能明显延长小鼠尾静脉的流血时间，提示它具有抗凝活性。PMSP-A抗凝的作用是否只与其水解纤维蛋白(原)有关，以及其影响血液凝固的机制尚待进一步的研究。

通过肽指纹图谱分析，PMSP-A的部分肽段与黄绿烙铁头(Trimeramaturus flavoviridis)蛇毒中一个具有抗凝活性的C型凝集素中异源二聚体中的链A部分序列吻合［12－13］。本实验纯化得到的 PMSP-A也能延长小鼠尾静脉流血时间，提示目标蛋白结构与功能间的内在联系。开展PMSP-A的结构研究将有助于加深对蛇毒丝氨酸蛋白酶结构与功能关系的理解和认识。

补体系统是机体免疫防御的第一道防线，具有重要的免疫调节作用。从蛇毒中已分离纯化出一些具有抗补体作用的蛋白酶，这些蛋白酶主要是通过酶切的方式作用于补体，例如从黄绿烙铁头蛇毒中分离出的丝氨酸蛋白酶flavoxobin［14］，它具有C3/C5转化酶活性，能酶切补体C3、C5，生成生理活性片段。本课题组从原矛头蝮蛇毒中纯化得到了一个具有抗补体活性的金属蛋白酶TMAC-1，它能够裂解补体C3和C5，但酶切产物不能激活内皮细胞释放P-selectin［15］。PMSP-A在预孵条件下能明显抑制补体经典途径溶血，但不预孵条件下几乎不能抑制补体经典途径溶血，表明PMSP-A是通过酶切方式作用于补体系统。补体系统和血液系统中起关键作用的酶都是丝氨酸蛋白酶。PMSP-A是蛇毒丝氨酸蛋白酶，它既能作用于补体，又能影响血液的正常凝集，其酶切补体只是偶然的底物适配或是具有特殊的生物学功能和意义，值得进一步研究探讨。

本工作从湖南产原矛头蝮蛇毒中分离纯化出一个新颖的双链丝氨酸蛋白酶PMSP-A，它具有纤维蛋白(原)水解活性，能明显延长小鼠尾静脉流血时间，同时它也具有抗补体活性。本研究将能加深对原矛头蝮蛇毒蛇伤的认识和理解，能为其蛇伤防治提供有益的思路和参考，同时，PMSP-A对血液系统的作用和潜在应用值得进一步研究评价。

［1］涂光俦，冉永禄.近年来蛇毒酶研究的进展［M］//陈远聪，李文杰，主编.中国生物化学会专题讨论会文集(2):蛇毒的生化、毒理和应用.北京:科学出版社，1983:1－8.

［1］Tu G C，Ran Y L.Research progress of snake venom enzymes in recent years［M］//Chen Y C，Li W J，chief ed.Symposium anthology of the Chinese society of biochemistry(2):Biochemistry，toxicology and application of snake venom.Beijing:Science Press，1983:1－8.

［2］Wei J F，Wei Q，Lu Q M，et al.Purification，characterization and biological activity of an L-amino acid oxidase from Trimeresurus mucrosquamatus venom［J］.Acta Bichim et Biophys Sin，2003，35(3):219－24.

［3］Chen Y S，Huang C H，Chiou S H.Characterization and molecular cloning of one novel C-type lectin from the venom of Taiwan habu(Trimeresurus mucrosquamatus)［J］.Toxicon，2010，55(4):762－72.

［4］Hung C C，Chiou S H.Fibrinogenolytic proteases isolated from the snake venom of Taiwan Habu:serine proteases with kallikrein-like and angiotensin-degrading activities［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，281(4):1012－18

［5］Sun Q Y，Li M，Yang F M.Purification and characterization of a metalloproteinase with weak fibrinogenolytic activity from Naja atra venom［J］.Chin J Biochem Mol Biol，2007，23(10):835 －43.

［6］Sun Q Y，Bao J.Purification，cloning and characterization of a metalloproteinase from Naja atra venom［J］.Toxicon，2010，56(8):1459－69.

［7］Ownby C L，Bjarnason J，Tu A T.Hemorrhagic toxins from rattlesnake(Crotalus atrox)venom.Pathogenesis of hemorrhage induced by three purified toxins［J］.Am J Pathol，1978，93(1):201－18.

［8］Gutiérrez J M，Romero M，Díaz C，et al.Isolation and characterization of a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity from the venom of the snake Bothrops asper(terciopelo)［J］.Toxicon，1995，33(1):19－29.

［9］Chiou S H，Huang K F，Chow L P，et al.Isolation of a venom factor devoid of proteolytic activity from Taiwan Habu(Trimeresurus mucrosquamatus):N-Terminal sequence homology and no functional similarity to factors IX/X-Binding proteins and botrocetin［J］.J Protein Chem，1996，15(7):667 －74.

［10］Swenson S，Markland F S Jr.Snake venom fibrin(ogen)olytic enzymes［J］.Toxicon，2005，45(8):1021 －39.

［11］Matsui T，Fujimura Y，Titani K.Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1477(1-2):146－56.

［12］Atoda H，Morita T.A novel blood coagulation factorⅨ/factorⅩ-binding protein with anticoagulant activity from the venom of Trimeresurus flavoviridis(habu snake):Isolation and characterization［J］.J Biochem，1989，106(5):808－13.

［13］Atoda H，Ishikawa M，Yoshihara E，et al.Blood coagulation factorⅨ-binding protein from the venom of Trimeresurus flavoviridis:Purification and characterization［J］.J Biochem，1995，118(5):965－73.

［14］Yamamoto C，Tsuru D，Oda-Usda N，et al.Flavoxobin，a serine protease from Trimeresurus flavoviridis(habu snake)venom，independently cleaves Arg726-Ser727 of human C3 and acts a novel，hererologous C3 convertase［J］.Immunology，2002，107(1):111－7.

［15］闫银萍，孙黔云.烙铁头蛇毒中一个抗补体活性金属蛋白酶的纯化和性质研究［J］.中国药理学通报，2010，26(9):1220－25.

［15］Yan Y P，Sun Q Y.Purification and characterization of a metalloproteases with anti-complementary activity from Trimeresurus mucrosquamatus Venom［J］.Chin Pharrmacol Bull，2010，26(9):1220－5.