劳海红 贺宪民

1.海南省妇幼保健院(海口，570206);2.海南主健细胞分子遗传医学检验中心

5，10－亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢通路中的关键酶。MTHFR C677T与神经管缺陷(NTDs)的关联关系研究在国内和国外开展很普遍，TT基因型是NTDs发生的遗传危险因素;MTHFR A1298C、MTRR A66G也都在国内和国外的人群中被研究证明与NTDs的发生相关。神经管缺陷是一类发生率高、后果严重的出生缺陷，是遗传因素和环境因素共同作用的结果，为多基因遗传疾病［1］。本研究的目的在于比较海南省汉族和黎族妇女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G多态性分布情况，获得群体遗传学特征，了解叶酸代谢相关基因在不同人群的分布，为不同人群预防出生缺陷制定针对性的干预措施提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

依据知情同意，选择在海南省各保健院进行孕前或孕期检查的女性作为研究对象，其中，汉族10 533人，黎族904人。

1.2 仪器及试剂

Centrifuge离心机(德国艾本德公司);7900HT实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司);3730测序仪、9700 PCR扩增仪、荧光定量缓冲液、荧光定量检测探针、BigDye® Terminator v3.1测序试剂盒、测序缓冲液(ABI公司)和POP－7TM3730/3730xl DNA测序胶(美国生命技术公司)。检测中对3个位点分别进行荧光定量PCR反应，反应所用Taqman－MGB探针信息见表1。

表1 Taqman－MGB探针所在位置

1.3 研究方法

1.3.1 样本DNA采集 采集受检者的口腔黏膜上皮细胞，利用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA。

1.3.2 基因检测 MTHFR 基因 C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点的SNP分型采用Taqman－MGB技术。

1.3.3 荧光定量PCR反应条件 每个反应体系为总体积 10μl，包含浓度为 20ng/μl的 DNA 模板1μl，2 × Taqman Universal MasterMix 5μl，20 × Taqman－MGB 探针0.5μl，去离子水3.5μl。反应条件为95℃ 10min，随后进行20个循环的扩增(92℃15s，60℃ 1min)，再进行30个循环的扩增(89℃15s，60℃ 90s)。反应结束后在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

1.4 数据统计分析

对获得的数据用Excel汇总分析，不同人群间基因型及等位基因频率用χ2检验分析。

2 结果

2.1 研究对象基因型频数分布比较(表2)

表2 两民族妇女MTHFR、MTRR基因型频数和频率分布［例(%)］

2.2 研究对象的等位基因频率比较

汉族妇女MTHFR C677T突变等位基因T 频率高于黎族妇女，而黎族妇女MTHFR A1298C突变等位基因C、MTRR A66G突变等位基因G则高于汉族妇女(P ＜0.01)。见表3。

表3 两民族妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G等位基因频率和频率分布［例(%)］

3 讨论

一些研究报道，不同种族人群MTHFR基因热敏性多态性基因型分布存在差异，如国内裴丽君等［2］报道的中国汉蒙两族存在民族差异，但未见有关黎族的研究报道。贺宪民等［3］报道:MTHFR C677T位点纯合突变基因型TT的频率北方显著高于南方(P＜0.01);南方的四川省和海南省间的差异有统计学意义(P=0.02)。MTHFR A1298C基因北方纯合突变基因型CC的频率显著低于南方(P＜0.01)，南方的四川省和海南省间无差异。MTRR A66G基因型的构成在北方和南方间无统计学差异;纯合突变基因型GG的构成在北方和南方间无统计学差异。

本研究比较了海南省汉族和黎族妇女的MTHFR C677T位点纯合突变基因 TT、MTHFR A1298C纯合突变基因CC和MTRR A66G纯合突变基因GG的频率后发现，海南汉族妇女MTHFR C677T纯合突变基因TT频率明显高于海南黎族妇女，而海南黎族妇女MTHFR A1298C纯合突变基因CC和MTRR A66G纯合突变基因型GG频率显著高于海南汉族妇女。海南汉族妇女MTHFR C677T突变等位基因T频率显著高于海南黎族妇女，而海南黎族妇女MTHFR A1298C突变等位基因C、MTRR A66G突变等位基因G则显著高于海南汉族妇女。

目前认为，MTHFR和MTRR是叶酸代谢过程的关键酶，如果这些酶活性或浓度下降均可使同型半胱氨酸的甲基化发生障碍，导致同型半胱氨酸水平升高，是心血管系统疾病和子代发生NTDs的重要危险因素。国外研究表明，携带MTHFR突变基因型的个体发生冠心病的危险性增加，父母携带突变基因型增加子代 NTDs发生的危险性［4，5］。国内李智文等［6］报道，携带MTHFR突变基因型的个体发生冠心病以及子代发生NTDs的危险性显著上升;特别是携带纯合突变基因型的个体，其冠心病发生的危险性是野生型的2.35倍;父母携带纯合突变基因型，子代NTDs的危险性增加3.13倍。

本研究显示，海南省汉族和黎族妇女MTHFR和MTRR基因多态性分布存在显著差异。这种差异要求在制定相关人群健康干预方案时不能使用统一模式、执行统一标准，而应是因人而异，制定有针对性的干预措施。

1 朱军，王和.增补小剂量叶酸预防神经管缺陷［M］.成都:成都时代出版社，2008:1－4.

2 裴丽君，朱慧萍，沈婉英，等.中国汉蒙两族人群MTHFR基因热敏感性多态性分布的比较［J］.遗传，2000，22(6):371.

3 贺宪民，张群，杨琦，等.亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究［J］.中国计划生育学杂志，2010，18(1):15－16.

4 Pan XR，Li GW，Hu YH，et al.Effects of diet and exercise in preventing NIDDM in people with impaired glucose tolerance:the Da Qing IGT and Diabetes Study ［J］.Diabetes Care，1997，20(4):537－544.

5 UK Prospective Diabetes Study Group.Effect of intensive bloodglucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes［J］.Lancet，1998，352(9139):854－856.

6 李智文，张晖，王丽娜.中国人5，10亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病、神经管畸形易感性关系的Meta分析［J］.中国慢性病预防与控制，2004，12(4):165.