王 会, 何孔旺，陆承平

（1.山东省枣庄市畜牧兽医局，枣庄277100；2.江苏省农科院兽医研究所，南京210014；3.南京农业大学，南京210095）

大肠杆菌热敏肠毒素（Escherichia coli heat-1abile enterotoxin，LT）是产肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia col，ETEC)的 毒 力 因子之一，也是迄今为止已知的最强的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂，但LT强烈的致腹泻毒性限制了它的实际应用[1,2]。LT由1个A亚基(LTA)和5个B亚基(LTB)组成，LTA是其毒素活性中心，而LTB是其免疫原性中心，无毒性，并且单独的LTB亦具有免疫佐剂活性。本实验构建pET32a/LTB原核表达质粒，表达重组LTB蛋白，不仅可用于亚单位疫苗研制，还可以进行黏膜免疫佐剂的研究。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 大肠杆菌K88（LT+，ST+）株，DH5α，BL21（code plus），原核表达质粒pET32a均由江苏省农业科学院兽医所保存。

1.2 主要试剂 引物由上海捷倍斯（Genebase）公司合成；HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；GM1，兔源抗CTB抗体为Sigma公司产品。

1.3 PCR及AT克隆 按照GenBank中大肠杆菌热敏肠毒素(LT)的基因序列，选用lt基因3'端抗原性较强的128个氨基酸，包括LTB全基因（ORF：864-1299，共436 bp），自行设计一对引物。煮沸法制备大肠杆菌模板，PCR扩增目的基因，预计扩增片段长度为454 bp。

P1：5'- CGCGAATTCATGAATAAAGTAAAATG-3' EcoRⅠ

P2：5'-AAGGTCGACTTAGTATAAGTACAGTA-3' Sal I

PCR产物经双酶切回收后定向克隆至pMD 18-T载体，转化DH5α感受态细胞，碱裂解法提取质粒后进行双酶切鉴定。阳性质粒命名为pMD18/LTB，并对其进行基因测序。

1.4 LTB的原核表达

1.4.1 重组表达质粒pET32a/LTB的构建对阳性克隆质粒pMD18/LTB进行双酶切，切下LTB目的基因与同样双酶切的表达载体pET32a连接，构建pET32a/LTB重组表达质粒，转化入大肠杆菌BL21（code plus）。同上抽提质粒并进行酶切鉴定。阳性质粒命名为pET/LTB，并进行测序。

1.4.2 重……