丁 雪,罗晓东,罗洁琳,李小敏,沈浩贤,陈代雄

近几十年来,各种变态反应性疾病如过敏性鼻炎、皮炎、支气管哮喘和变应性结膜炎等的流行呈逐年上升趋势[1],已成为全球性的健康问题[2]。变态反应性疾病是接触变应原后人体产生的一种免疫病理反应过程[3]。现有资料证明[4],尘螨是引起变态反应性疾病最重要的变应原之一。而尘螨中又以粉尘螨(Dermatophagoidesf arinae)和屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)数量最多、分布最广、危害最大[5-7]。但是一方面屋尘螨和粉尘螨的分布不完全相同,另一方面两者又常在同一环境中同时存在,因此了解某一地区或环境中尘螨的种类和优势螨种,对过敏性疾病的诊断、预防和治疗是非常重要的。本研究尝试用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测。

1 材料和方法

1.1 试剂 粉尘螨原种由中山医学院提供,在本实验室进行培养繁殖用于实验;屋尘螨购自瑞典Al-lergon公司。DNA聚合酶、PCR试剂盒和 DNA Marker从 TAKARA公司购买。其它试剂:如乙醇、酚、氯仿、异戊醇均为分析纯。

1.2 仪器 1-15PK离心机为SIGMA公司生产;S1000TMPCR仪由BIORAD公司生产;WS-01恒温恒湿培养箱由湖北黄石恒丰医疗器械有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 粉尘螨和屋尘螨DNA提取 参照赵亚娥[8]和王继英[9]等报告的方法进行。

1.3.2 随机引物PCR扩增 参考陈观今等[10]的研究报告设计随机引物,由Invitrogen公司合成。两条引物分别为 RP1、RP3,序列如下:RP1:5'-GAG GCC AGT-3';RP3:5'-GCA ACG CAA T-3'。分别以粉尘螨和屋尘螨DNA为模板进行PCR扩增,PCR 反应体系 25μL(5×PCR Buffer 5μL,上下游引物各 1μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,模板0.5μL,PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.5μL,ddH2O 13μL);反应条件参考赵亚娥[8]、周华云等[11]报告:94℃5min预变性,94℃ 1min、36℃1min、72℃2min反应45个循环,72℃延伸 10min。……