孙凤丹 李月龙 韩忠波

异烟肼(INH)作为最主要的一线抗结核药物之一，对其耐药性的研究日益受到重视。国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，与inhA基因突变也有相关性［1］。我们采用采用PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法检测了95株肺结核患者痰标本临床分离株，并对47例结核患者痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 95株结核分枝杆菌临床分离株和47例肺结核患者涂阳痰标本。95株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中51株对异烟肼耐药，44例对异烟肼敏感。47例肺结核患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中18例对异烟肼耐药，29例对异烟肼敏感。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用传统酚/氯仿抽提法提取标本中 DNA［2］。

1.2.2 PCR扩增 采用25ul反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mm01/l，引物终浓度为0.2 umol/L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸 l min，循环 30 次，最后 72℃延伸l0 min。扩增产物扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带、rpsL出现267bp条带即为扩增阳性。

1.2.3 SSCP银染 PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10 min，立即冰浴5 min，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃100 V电压，电泳约2～3 h，电泳结束后.，取凝胶板经硝酸银染色，观察结果并照相。

2 结果

2.1 PCR扩增，以结核分支杆菌H37RV为对照，44株药物敏感株、51株耐INH分离株KatG、inhA基因扩增均为阳性;47例耐INH肺结核患者痰标本中，KatG基因44例扩增阳性、inhA基因40例扩增阳性(见表1)。……