张铃铛 霍钢 肖文峰 杜安东 吴留洋 车朋余

垂体腺瘤约占颅内肿瘤的10%［1］，临床上分为侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤，侵袭性垂体瘤手术治疗困难，术后容易复发，患者预后差。侵袭性垂体腺瘤发病的确切机制尚未完全明确。本研究应用14 500条全长基因的PCR产物为靶基因制成寡聚核苷酸基因表达谱芯片筛选侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤差异表达基因，分析与侵袭性垂体腺瘤发病相关的可能基因，结合相关生物信息学方法，基于全基因组水平对侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤发生发展的相关基因进行筛选和分析，为探索侵袭性垂体腺瘤的发病机制提供研究方向和线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年3月至9月重庆医科大学附属第一医院神经外科垂体腺瘤标本12例，其中男5例，女7例，年龄23～68岁，平均(43.3±0.4)岁。侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤组织各6例，按侵袭性垂体腺瘤的判断标准［2］，符合其中之一者即可确定为侵袭性垂体腺瘤，否则为非侵袭性垂体腺瘤。取得肿瘤组织迅速在生理盐水中去除血渍，PBS缓冲液;冲洗后，锡箔包裹置液氮(－80℃)中保存。

1.2 基因芯片的制备及杂交 采用TRIzo1一步法分别提取侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤组织总RNA，并用RNeasy MiniKit(QIA·GEN)纯化，1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计评价RNA的质量和完整性。打开RNA的二级结构，反转录合成第一链cDNA和合成cDNA第二链后再纯化，体外转录合成aRNA并纯化，单色荧光标记aRNA，纯化单色荧光标记aRNA，42℃预热封闭缓冲液，检查芯片Human OneArrayTM(华联公司，每一芯片上布放32050个探针，包含30968个基因探针和1082个实验控制探针，上海生物芯片有限公司提供)的完整性，芯片缓缓的放入预杂交管内，42℃烘箱预杂交60 min，离心1 min甩干芯片上的水，扫描备用，将封闭后的芯片进行荧光扫描，目的是为了检验及确认芯片的品质。片段化aRNA置于室温避光备用。芯片置于50℃杂交培养箱(Hybridization Incubator)旋转架上，转速设为约2 r/min、孵育16 h芯片洗脱，置于42℃摇床以转速80 r/min摇动洗脱5min取出芯片，于洗液Ⅲ中上下移动漂洗十次。利用手掌式芯片离心机，去除芯片上的水份，将芯片置于黑色芯片盒中避光，准备扫描。

1.3 扫描和分析 芯片放Axon GenePix 4000B扫描仪上扫描，信号是扫描仪检测出的光强度经过均一化后的数据，应用Gene-Pix软件进行数据分析。均一化方法:将芯片所有探针组的荧光信号强度从小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%后，将剩下探针组的平均信号值调整500。采用ImageViewer图像处理软件提取杂交信号叠加图。侵袭性垂体腺瘤组和非侵袭性垂体腺瘤组对两张芯片上对应探针的荧光信号强度比值的对数(signal logratio，SLR)≥2.00，认为该基因表达上调，SLR≤－2.00认为该基因表达下调。

1.4 逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)从抽提的总RNA中RNA样品各1 μL进行反转录形成cDNA，再进行PCR。条件为95℃预变性5 min;95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35循环，最后72℃延伸10 min。实验所用核酸酶抑制剂、AMV反转录酶和Taq酶均由上海生物芯片有限公司提供。选取芯片结果中上调表达的CDH12基因进行验证，其上游引物5'TCTCTATTGATCCCAAGACAGGT3'，下 游 引 物 5'AATTTGATGACTCCCTCTTGTGT3'，扩增片段长308 bp;芯片结果中下调表达KLF4基因，上游引物5'CGCCTTGCTGATTGTCTATTT3'，下游引物 5'CCCAAAGTCAACGAAGAGAAG3'，扩增片段长度 171 bp，人GAPDH基因作为参照，上游引物5'ACCACAGTCCATGCCATAC3'，下游引物5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'，扩增片段长500 bp。引物设计来自Genbank，由上海生物芯片有限公司合成。PCR产物用250 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 基因芯片的筛选结果以Signal Log Ratio值定为±2标准，用高通量基因表达谱芯片筛选。侵袭性垂体腺瘤组和非侵袭性垂体腺瘤组比较，筛选出差异表达基因153条，侵袭性垂体腺瘤组上调表达基因63条，下调表达基因90条。基因芯片信号扫描图展示的是杂交完成的芯片在激光扫描仪下读出的实际图形如图1、2(部分基因芯片信号扫描图)，芯片采用的是生物素标记，单色荧光，激光扫描仪通过将光信号转换成数字信号来获得整张芯片每个点的信号。

2.2 Gene Ontology功能分析 153个差异表达基因主要分为7大功能组，见表1。表2和表3列出了上调表达和下调表达差异前10个基因及其相应功能以及基因公共数据库号。

2.3 RT－PCR验证结果上调基因CDH12和下调基因KLF4的验证结果见图3、4，结果证实目的基因A值比值与芯片结果变化趋势一致，验证了基因芯片结果的正确性。

3 讨论

垂体腺瘤属良性肿瘤，但由于部分垂体腺瘤可具有非良性肿瘤生长的特征，向邻近组织浸润生长而具侵袭性，肿瘤浸润是决定肿瘤患者预后的一个重要因素。目前普遍认为肿瘤浸润转移是由多基因、多因素参与的过程。在我们的研究中发现侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤存在明显差异的基因表达，这些差异表达基因的作用机制目前尚不清楚。本研究利用人类全基因组芯片首次全面分析侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤基因表达谱的差异，并对差异基因进行功能分析，从全基因组水平筛选和分析垂体腺瘤发生侵袭性的相关基因改变，这将对探索垂体腺瘤侵袭性发生发展的分子机制和治疗提供帮助。

图1 芯片杂交图

图2 芯片扫描图

表1 差异表达基因的Gene Ontology功能分类

表2 侵袭性垂体腺瘤组上调表达基因差异的前10名基因

表3 侵袭性垂体腺瘤组下调表达基因差异的前10名基因

图3 CDH12 mRNA在垂体腺瘤中的表达，1，2，3为非侵袭性垂体腺瘤，4，5，6为侵袭性垂体腺瘤，M为marker

用Gene Ontology功能分类标准对差异基因进行功能分析表明:差异表达基因13.3%与细胞结构有关，22.1% 与大分子代谢有关，25.0% 与信号传导通路有关，19.6%与细胞生理过程调节有关，10.8%与免疫有关，1.2%与癌基因有关，8.0%功能未知。上调表达基因主要涉及癌基因、免疫调节相关基因、代谢相关基因、信号传导等，下调表达基因主要涉及DNA结合、转录、免疫相关、信号传导和传递蛋白等。

图4 KLF4 mRNA在垂体腺瘤中的表达，1，2，3为侵袭性垂体腺瘤，4，5，6为非侵袭性垂体腺瘤，M为marker

本研究中，我们通过RT－PCR选取CDH12和KLF4两个基因对基因芯片结果进行了验证，验证的结果提示基因芯片结果的可靠性。通过基因芯片筛选，我们发现某些基因的差异表达可能与垂体腺瘤侵袭性相关，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂E－1(serpin peptidase inhibitor，clade E，member 1，SERPINE1)编码丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，该家族抑制组织纤维蛋白溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶(urokinase ，uPA)。我们前期研究发现在侵袭性性垂体腺瘤中uPA的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤组［3］，而N-cadherin12的高表达使MAPKERK信号转导系统激活，从而诱导MMP-9(matrix metalloproteinases－9)基因表达，促进肿瘤血管的形成，使肿瘤易于生长和转移［4］。在我们前期研究中也发现侵袭性垂体腺瘤中MMP－9表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤［5］。上述结果与Wierinckx A等［6］应用的cDNA芯片在侵袭性催乳素腺瘤中研究结果不一致，可能是基因芯片所含的信息量不同以及我们没有将侵袭性垂体腺瘤及非侵袭性垂体腺瘤进行分型分别比较不同类型基因表达的差异。此次研究采用了信息容量更大DNA芯片研究并进行了RT-PCR验证，发现了一些可能与侵袭性垂体腺瘤发病相关的新基因，但由于基因芯片筛查基因差异表达谱的样本量较少，我们将在后续的实验继续进行验证，探讨它们与垂体腺瘤侵袭性相关的可能途径。肿瘤侵袭性的发生由多基因、多分子、多步骤、多种因素参与的结果，对差异表达基因功能的进一步研究可以更好的揭示侵袭性垂体腺瘤发病机制，阐明多种基因如何在其发病中发挥作用，进而从基因水平上为侵袭性垂体腺瘤的诊断及治疗提供帮助。

［1］魏俊吉，王任直.垂体腺瘤发病机制和临床治疗的研究进展［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35(2):121.

［2］冯清林，霍钢，唐茂源，等.侵袭性垂体腺瘤中自噬相关基因Beclin-1和MAPLC3的表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36(8):476 －479.

［3］唐茂源，霍钢，冯清林，等.uPA和uPAR在侵袭性垂体腺瘤中的表达及意义［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36(9):547－549.

［4］Lamora A，Voigt MM.Cranial sensory ganglia neurons require intrinsic N－cadherin function for guidance of afferent fibers to their final targets［J］.Neuroscience，2009，159(3):1175 – 1184.

［5］李九州，霍钢，郑履平，等.MMP－9、HPA及CD34在侵袭性垂体腺瘤中表达的研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2007，33(7):404－407.

［6］Wierinckx A，Auger C，Devauchelle P，et al A diagnostic marker set for invasion，proliferation，and aggressiveness of prolactin pituitary tumors［J］.Endocrine － Related Cancer，2007，14(3):887 –900.